植入前遺傳學(xué)篩查中不同形態(tài)特征的胚胎整倍體率比較

施文浩，張四林，王永博，師娟子

(西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心，陜西 西安 710003)

在自然生殖發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞分裂時(shí)期染色體不分離、減數(shù)分裂時(shí)期染色單體提早分離和染色體丟失引起胚胎染色體異常包括數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常，數(shù)量異常更為常見(jiàn)，主要表現(xiàn)為非整倍體。隨著胚胎體外培養(yǎng)研究的深入，發(fā)現(xiàn)人類(lèi)胚胎染色體非整倍體改變?cè)隗w外受精一胚胎移植中十分常見(jiàn)[1]，是導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、著床失敗、自發(fā)流產(chǎn)、死產(chǎn)等妊娠失敗的主要原因[2]。植入前遺傳學(xué)篩查或診斷(preimplantation genetic screening/diagnosis，PGS/PGD)，在胚胎植入著床之前，對(duì)早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低流產(chǎn)率預(yù)防出生缺陷。但是PGS的主要缺點(diǎn)是有創(chuàng)，對(duì)胚胎后續(xù)發(fā)育有一定損傷[3]，且遠(yuǎn)期損害仍不明確[4]。其次檢測(cè)費(fèi)用居高不下，對(duì)于植入前遺傳學(xué)篩查的廣泛應(yīng)用造成困難。已有研究發(fā)現(xiàn)染色體的整倍體性與胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)存在一定關(guān)系[5-6]，因此有必要對(duì)預(yù)測(cè)整倍體的胚胎參數(shù)進(jìn)行研究，在無(wú)法進(jìn)行PGS時(shí)提供更有效的預(yù)測(cè)整倍體胚胎預(yù)測(cè)方法。本文從西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心PGS活檢胚胎染色體結(jié)果分析，比較不同發(fā)育形態(tài)參數(shù)胚胎的整倍體和非整倍體率，研究胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)參數(shù)與整倍體的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象與分組

收集2015年1月1日至2017年4月30日西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心行PGS的常規(guī)體外受精-胚胎移植患者，以其所檢測(cè)胚胎為研究對(duì)象。PGS檢測(cè)在西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳中心完成，采用微陣列比較基因組學(xué)技術(shù)(BlueGnome 24SureV3)檢測(cè)。所有進(jìn)入臨床PGS周期的患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1 體外受精胚胎培養(yǎng)及活檢

采用常規(guī)的促排卵方案，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡中有1個(gè)直徑達(dá)到18mm(或者有1/3個(gè)卵泡達(dá)到18mm)時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrophin,hCG)10 000IU，36～38h后經(jīng)陰道超聲下取卵。取卵后4～6h常規(guī)卵胞漿內(nèi)單精子注射，然后采用序貫培養(yǎng)(vitrolife G-series)胚胎至第3天或第6天，活檢時(shí)間為受精后第3～6天，卵裂期胚胎在第3天進(jìn)行卵裂球活檢，活檢1枚卵裂球送檢；囊胚在受精后第5天或第6天活檢，活檢部分外胚層細(xì)胞(5～10個(gè))送檢。活檢后卵裂期胚胎或囊胚冷凍保存。

1.2.2 卵裂期胚胎和囊胚的評(píng)分參數(shù)

卵裂期評(píng)價(jià)為多個(gè)參數(shù)的綜合評(píng)價(jià)，主要參數(shù)為D3天胚胎卵裂球數(shù)目、碎片體積比例和不均卵裂球數(shù)目。囊胚評(píng)價(jià)采用Garnder囊胚分級(jí)法。先根據(jù)囊胚的擴(kuò)張和孵出程度將囊胚分成1～6期，其中3期為完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔占據(jù)整個(gè)囊胚；4期為擴(kuò)張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變?。?期為正在孵化的囊胚，囊胚正在從透明帶破裂口孵出；6期為孵化出的囊胚,囊胚完全從透明帶中脫出。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外胚層細(xì)胞評(píng)分根據(jù)細(xì)胞數(shù)目和緊湊程度評(píng)價(jià)，A級(jí)為細(xì)胞數(shù)目多，結(jié)合緊密；B級(jí)為細(xì)胞數(shù)目較少，結(jié)合較松散；C級(jí)為細(xì)胞數(shù)目極少。

1.2.3 PGS檢測(cè)

活檢細(xì)胞采用單細(xì)胞基因組擴(kuò)增，采用SurePlex DNA Amplification System 試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，然后通過(guò)array-CGH方法(Blue Gnome 24SureV3 package kit)對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，BlueFuse Multi軟件分析并出具PGS報(bào)告。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)采用SPSS 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，率的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料率的檢驗(yàn)采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或非參檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1基本數(shù)據(jù)

PGS共活檢348枚胚胎，成功檢測(cè)322枚胚胎，其中整倍體胚胎數(shù)目為123(38.20%)，非整倍體胚胎數(shù)目為199(61.80%)，整倍體與非整倍體胚胎的基本數(shù)據(jù)詳見(jiàn)表1。其中PGS指征和男方正常精子形態(tài)率的整倍體與非整倍體率比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1整倍體與非整倍體胚胎的基本數(shù)據(jù)[χ±S,n(%)]

Table 1Basic data of aneuploid and aneuploid embryos[χ±S,n(%)]

項(xiàng)目整倍體(n=123)非整倍體(n=199)t/χ2P母親年齡(歲)31．37±3．8032．23±5．09-0．930．35男方年齡(歲)33．20±4．6634．21±6．03-1．040．30不孕癥類(lèi)型0．640．43　原發(fā)32(26．02)60(30．15)　繼發(fā)91(73．98)139(69．85)女方基礎(chǔ)促卵泡素6．33±2．456．74±2．43-1．430．16PGS指征7．890．02　復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及　反復(fù)種植失敗62(50．41)105(52．76)　不良孕產(chǎn)史24(19．51)18(9．05)　其他37(30．08)76(38．19)　基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(個(gè))13．80±5．8812．68±5．531．720．09　正常形態(tài)精子率(%)0．03±0．030．02±0．023．210．01

注：嵌合體按非整倍體計(jì)算。

2.2卵裂期胚胎參數(shù)與胚胎整倍體

卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)采用D3天胚胎卵裂球數(shù)目、碎片體積比例和不均卵裂球數(shù)目，比較整倍體與非整倍體間胚胎參數(shù)的差異。碎片體積比例在整倍體與非整倍體組中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，D3天胚胎卵裂球數(shù)目和不均卵裂球數(shù)目未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2卵裂期胚胎整倍體與非整倍體的胚胎參數(shù)比較(χ±S)

Table 2Comparison of embryo parameters between euploid and aneuploid in cleavage phase (χ±S)

項(xiàng)目整倍體(n=9)非整倍體(n=52)t/ZPD3卵裂球數(shù)目8．00±0．877．56±1．36-1．130．26碎片體積比例0．03±0．040．08±0．06-2．600．01不均卵裂球數(shù)目0．56±0．530．41±0．540．740．46

注：D3表示活檢時(shí)間為受精后第3天。

2.3囊胚參數(shù)與胚胎整倍體

囊胚評(píng)價(jià)參數(shù)采用活檢時(shí)間(D4～D5，D6)、囊胚擴(kuò)張期別(3期，4期，5～6期)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)(A/B，C)、外胚層形態(tài)(A/B，C)，比較不同囊胚參數(shù)之間整倍體與非整倍體發(fā)生率的差異。活檢時(shí)囊胚擴(kuò)張期別在整倍體與非整倍體發(fā)生率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05), 活檢時(shí)間(D4～D5，D6)、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)(A/B，C)和外胚層形態(tài)(A/B，C)未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)，見(jiàn)表3。

表3囊胚參數(shù)的整倍體與非整倍體發(fā)生率比較[n(%)]

Table 3 Comparison of the incidence of euploidy and aneuploidy in parameters of blastocyst[n(%)]

項(xiàng)目整倍體(n=114)非整倍體(n=147)χ2P活檢時(shí)間　D4～D590(78．95)116(78．91)00．99　D624(21．05)31(21．09)活檢時(shí)的囊胚評(píng)分　擴(kuò)張期別　　3期8(7．02)19(12．93)2．000．01　　4期92(80．70)123(83．67)　　5～6期14(12．28)5(3．40)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)　A/B65(57．02)84(57．14)00．98　C49(42．98)63(42．86)外胚層形態(tài)　A/B21(18．42)37(25．17)1．690．19　C93(81．58)110(74．83)

注：D4～6表示活檢時(shí)間為受精后第4～6天；囊胚評(píng)分采用Garden評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)。

3討論

3.1胚胎發(fā)育形態(tài)參數(shù)與非整倍體的相關(guān)性

胚胎染色體的非整倍體與胚胎發(fā)育密切相關(guān)，2011年Alfarawati研究顯示卵裂期胚胎中染色體非整倍體現(xiàn)象普遍存在，而形態(tài)評(píng)分較差的胚胎，其染色體非整倍體率高于形態(tài)較好胚胎。囊胚期胚胎形態(tài)也與染色非體整倍體可能相關(guān)，2011年關(guān)小紅研究提示形態(tài)學(xué)評(píng)分較差的廢棄胚胎繼續(xù)培養(yǎng)，其中大部分囊胚發(fā)育延緩且形態(tài)較差, 活檢PGS后染色體異常發(fā)生率相對(duì)較高。仍有研究提示囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)形態(tài)評(píng)分對(duì)整倍體囊胚移植后的持續(xù)臨床妊娠率有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值[7]。因此胚胎染色體非整倍體體與胚胎形態(tài)可能存在一定的相關(guān)性。

3.2卵裂期胚胎碎片和活檢時(shí)囊胚擴(kuò)張形態(tài)與非整倍體

本研究結(jié)果顯示卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高，檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，D 3天胚胎卵裂球數(shù)目和不均卵裂球數(shù)目未檢驗(yàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。囊胚形態(tài)參數(shù)中活檢時(shí)的囊胚擴(kuò)張期別越高，整倍體率越高。由此推測(cè)，早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發(fā)育較快的胚胎整倍體率可能較高。

已有研究提示，卵裂期胚胎碎片比例較高的胚胎，檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)染色體異常風(fēng)險(xiǎn)較高，如有研究報(bào)道碎片比例>35%的卵裂期胚胎形成的囊胚中，染色體異常率為70%～90%[8]。2001年Ebner發(fā)現(xiàn)碎片較高的胚胎移植后妊娠結(jié)局較差，胎兒畸形率較高，由此說(shuō)明胚胎的非整倍體和胚胎碎片比例有一定的相關(guān)性，碎片比例較高的胚胎染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)較高。胚胎染色體異常與胚胎發(fā)育關(guān)系密切，有研究指出染色體異?？蓪?dǎo)致不同階段胚胎發(fā)育停滯，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間后染色體異常的胚胎可能出現(xiàn)發(fā)育停滯等，整倍體胚胎可能繼續(xù)發(fā)育，因此囊胚階段發(fā)育較快的囊胚的整倍體概率可能更高[9-10]。

通過(guò)我院PGS患者的染色體結(jié)果分析得出，卵裂期胚胎評(píng)價(jià)參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高,囊胚形態(tài)參數(shù)中活檢時(shí)的囊胚擴(kuò)張期別越高，整倍體率較高。因此早期胚胎卵裂期胚胎碎片少、囊胚發(fā)育較快的胚胎整倍體率較高。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Kort D H, Chia G, Treff N R,etal.Human embryos commonly form abnormal nuclei during development: a mechanism of DNA damage, embryonic aneuploidy, and developmental arrest[J]. Hum Reprod,2016,31(2):312-323.

[2]Chang J, Boulet S L, Jeng G,etal. Outcomes of in vitro fertilization with preimplantation genetic diagnosis: an analysis of the United States Assisted Reproductive Technology Surveillance Data, 2011-2012[J]. Fertil Steril,2016,105(2):394-400.

[3]Fragouli E, Wells D. Aneuploidy screening for embryo selection[J]. Semin Reprod Med,2012,30(4):289-301.

[4]Dahdouh E M, Balayla J, García-Velasco J A. Impact of blastocyst biopsy and comprehensive chromosome screening technology on preimplantation genetic screening: a systematic review of randomized controlled trials[J]. Reprod Biomed Online, 2015,30(3):281-289.

[5]Stensen M H, Tanbo T G, Storeng R,etal. Fragmentation of human cleavage-stage embryos is related to the progression through meiotic and mitotic cell cycles[J].Fertil Steril,2015,103(2):374-381.

[6] Fragouli E, Wells D. Aneuploidy screening for embryo selection. SeminReprod Med,2012 ,30(4):289-301.

[7]Irani M, Reichman D, Robles A,etal.Morphologic grading of euploid blastocysts influences implantation and ongoing pregnancy rates[J].Fertil Steril, 2017,107(3):664-670.

[8]Minasi M G, Colasante A, Riccio T,etal.Correlation between aneuploidy, standard morphology evaluation and morphokinetic development in 1730 biopsied blastocysts: a consecutive case series study[J].Hum Reprod, 2016,31(10):2245-2254.

[9]Barash O O, Ivani K A, Willman S P,etal. Association between growth dynamics, morphological parameters, the chromosomal status of the blastocysts, and clinical outcomes in IVF PGS cycles with single embryo transfer[J].J Assist Reprod Genet, 2017,34(8):1007-1016.

[10]石青青,孫海翔.單細(xì)胞多重替代擴(kuò)增法結(jié)合比較基因組雜交技術(shù)檢測(cè)植入前發(fā)育停滯胚胎染色體非整倍性[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,40(7):772-775.