玉竹配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

楊學(xué)芳　蘇萬福　孫文娟

玉竹又名葳蕤、女萎[1]，為百合科黃精屬[2]植物玉竹的干燥根莖，為傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材，具有滋陰、潤(rùn)肺、養(yǎng)胃生津等功效。該植物不僅作為藥品應(yīng)用，還廣泛應(yīng)用于保健品以及食療中[3]，是衛(wèi)生部公布的藥食兼用87種植物之一[4]。配方顆粒具有體積小、易于保存、易于攜帶、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，突破了傳統(tǒng)中藥飲片煎煮服用的模式，給患者用藥帶來方便。雖然中藥配方顆粒優(yōu)勢(shì)明顯，但基礎(chǔ)研究還相對(duì)薄弱[5]，目前關(guān)于玉竹配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究還未見報(bào)道。2015版《中國藥典》中玉竹飲片項(xiàng)下，對(duì)本品的薄層鑒別未做研究，不能為玉竹配方顆粒的定性研究提供參考，且定量方法只適用于單一飲片中玉竹多糖的測(cè)定，不適用工藝中以麥芽糊精為輔料進(jìn)行干燥制粒的配方顆粒中的玉竹多糖的測(cè)定。

玉竹飲片的提取物由于黏度大、干粉軟化點(diǎn)較低，噴霧干燥存在黏壁現(xiàn)象，試驗(yàn)表明，采用加入一定比例的麥芽糊精進(jìn)行真空干燥的方式較為可行，但麥芽糊精的加入影響了產(chǎn)品中活性成分玉竹多糖[6]的含量測(cè)定。多糖是一類成分較為復(fù)雜的混合物，常用的測(cè)定方法是比色法，利用水提醇沉的方式將多糖與小分子糖類分離后顯色測(cè)定，但麥芽糊精是一類易溶于水不溶于乙醇的糖類輔料，醇沉不能將其與多糖分離，從而會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品中多糖測(cè)定含量偏高。本研究采用糖化酶將麥芽糊精水解為小分子糖類，再用醇沉的方式將其去除[7]，從而消除麥芽糊精對(duì)玉竹多糖含量測(cè)定的干擾，為含麥芽糊精類配方顆粒中多糖測(cè)定方法的建立提供參考，為規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器 UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）；XS 205電子分析天平（梅特勒）；DD70薄層成像儀（德國迪賽克），TDL-40B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500B超聲儀 (江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；HH恒溫水浴鍋（金壇市中大儀器廠）；硅膠G板（青島海洋化工分廠）。

1.2試藥與藥品 D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506，含量以99.9%計(jì)），玉竹對(duì)照藥材（批號(hào)：121467-201103，3g/支），均購于中國食品藥品檢定研究院；玉竹配方顆粒，濟(jì)川藥業(yè)集團(tuán)有限公司自制；麥芽糊精（批號(hào)：160714，安徽山河藥用輔料股份有限公司）；硫酸為優(yōu)級(jí)純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；苯酚為生化試劑（綠葉集團(tuán)）；水為超純水，實(shí)驗(yàn)室自制；其余試劑均為分析純。

2　TLC定性鑒別

取本品0.3 g，加乙醇30 mL，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。另取玉竹對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液10μL、對(duì)照藥材溶液15μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上使成條帶狀，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （3∶1∶4∶0.2） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1所示。

圖1　玉竹配方顆粒TLC圖譜

3　玉竹多糖含量測(cè)定

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取對(duì)照品12.66 mg，置20 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

精密量取對(duì)照品溶液1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0 mL，分別置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各2 mL，置具塞比色管中，分別加4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，置冰水浴中5分鐘，取出，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法 (《中國藥典》2015年版四部通則0401)，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.0509X+0.0089，r=0.999 1，表明D-無水葡萄糖在2.53 μg/mL～12.65μg/mL的范圍內(nèi)與其吸光度呈良好的線性關(guān)系。

3.2供試品溶液的制備及測(cè)定方法 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加熱水100 mL使溶解，放冷，加入糖化酶0.05 g，搖勻，置37℃干燥箱中保溫2小時(shí)。取出，煮沸5分鐘使酶失活。趁熱過濾，放冷并適當(dāng)濃縮，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加水稀釋刻度。精密量取2 mL，置20 mL離心管中，加乙醇10 mL攪拌，離心10分鐘（4000 r/min），取沉淀加2 mL熱水溶解，重復(fù)醇沉離心一次。沉淀加水稍清洗，棄去洗液，沉淀轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取2 mL，照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法，自“4%苯酚溶液1 mL”，依法測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量[8-9]。

3.3精密度試驗(yàn) 按上述方法測(cè)定D-無水葡萄糖，取同一對(duì)照品溶液連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.29%（n=6），表明該方法精密度良好。

3.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：1610013）6份，按3.2項(xiàng)下方法操作，依法測(cè)定D-無水葡萄糖的含量。結(jié)果平均含量為22.87 mg/g，RSD為1.21%（n=6），表明該方法重復(fù)性較好。

3.5穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取對(duì)照品溶液及玉竹配方顆粒（批號(hào)：1610013）供試品溶液，按上述檢測(cè)條件，分別于0、0.5、1、3.5、4.5、6小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定D-無水葡萄糖吸光度。RSD分別為0.82%（n=6）、0.53%（n=6），表明對(duì)照品及供試品溶液在6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性較好。

3.6加樣回收率 試驗(yàn)取供試品6份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入D-無水葡萄糖對(duì)照品12 mg，照3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定。結(jié)果平均回收率為95.0%，RSD=0.70%（n=6），結(jié)果見表1所示。

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果?。╪=6）

3.7樣品測(cè)定 分別精密稱定三批玉竹配方顆粒（批號(hào)：1610013、1610023、161033） 約1 g，按4.2項(xiàng)下方法制備供試品，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定D-無水葡萄糖的含量，結(jié)果見表2所示。

表2　三批樣品中D-無水葡萄糖含量測(cè)定結(jié)果

4　討論

（1）薄層鑒別試驗(yàn)研究過程中，曾吸取供試品溶液1μL、對(duì)照藥材溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，顯色后發(fā)現(xiàn)，供試品及對(duì)照藥材斑點(diǎn)均不夠清晰；后嘗試進(jìn)一步加大點(diǎn)樣量，吸取供試品溶液3μL、5μL，對(duì)照藥材10μL、15μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上雖顯相同顏色的斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)仍不夠清晰，分離效果不理想；下一步在加大點(diǎn)樣量的同時(shí)將斑點(diǎn)點(diǎn)成條帶狀，吸取供試品10μL、對(duì)照藥材15μL分別以條帶狀點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，分離效果較好，因此確定該方法為玉竹配方顆粒的薄層鑒別方法[10]。

（2）糖化酶用量考察：研究過程中發(fā)現(xiàn)，糖化酶的用量過多或過少均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，過多時(shí)溶液濃度高顏色深，干擾吸收導(dǎo)致測(cè)定值偏高；用量不足時(shí)，不能將麥芽糊精水解完全，同樣會(huì)導(dǎo)致測(cè)定值偏高；通過一系列試驗(yàn)，最終確定了酶（糖化酶）與底物（麥芽糊精）的比例為5∶1時(shí)，為最佳比例，結(jié)合玉竹配方顆粒的工藝中主藥與麥芽糊精比例為4∶1，故主藥取1 g時(shí)，對(duì)應(yīng)糖化酶的加入量為0.05 g。

（3）酶解溫度考察：研究中分別考察了產(chǎn)品在60℃及37℃條件下的酶解情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解溫度為60℃時(shí)，在預(yù)設(shè)的幾個(gè)時(shí)間段內(nèi)，含量波動(dòng)較大不穩(wěn)定，且總體較高，說明麥芽糊精沒有完全酶解，考慮原因?yàn)?0℃時(shí)，酶部分失活，導(dǎo)致麥芽糊精水解不完全，因此選定酶解溫度為37℃，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察酶解時(shí)間。

（4）酶解時(shí)間考察：固定酶解溫度為37℃的條件下，取玉竹配方顆粒8份，每份約1 g，酶解時(shí)間分別設(shè)置0.5、1、2、4、6、8、12、24小時(shí)，進(jìn)一步考察糖化酶的酶解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)酶解時(shí)間為2小時(shí)時(shí)，吸光度趨于平穩(wěn)，表明此時(shí)樣品中麥芽糊精已水解完全。見圖2。

圖2　糖化酶對(duì)麥芽糊精水解能力測(cè)定結(jié)果

由于酶解反應(yīng)具有高度的專一性，糖化酶對(duì)α-1，4糖苷鍵和α-1，6糖苷鍵有水解能力，僅可水解玉竹配方顆粒中的麥芽糊精，無法水解玉竹中含有的玉竹黏多糖、玉竹果聚糖等成分，故此法可以有效排除麥芽糊精對(duì)活性成分玉竹多糖測(cè)定的干擾。

綜上所述，文中的定性及定量方法科學(xué)、準(zhǔn)確，具有良好的可控性及重復(fù)性，可用于玉竹配方顆粒的質(zhì)量控制。

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