雌激素受體α基因rs1062577位點多態(tài)性與壯族男性不育的相關(guān)性分析

李潔 陳文成 元輝雄 韋玉霞 龐艷芳 王俊利

【關(guān)鍵詞】 雌激素受體基因α;男性不育;基因多態(tài)性;相關(guān)性分析

中圖分類號：R698+.2;R394.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.01.003

Analysis of correlation between gene polymorphism at rs1062577 locus of ESRα and male infertility in Zhuang nationality

LI Jie1，CHEN Wencheng，YUAN Huixiong，WEI Yuxia，PANG Yanfang，WANG Junli

【Abstract】 Objective To investigate correlation between male sterility of Zhuang nationality in western Guangxi and the single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of estrogen receptor α （ESRα） in Zhuang nationality.

Methods Case-control method was used for the study，and TaqMan probe real-time PCR technique was used to perform genotyping of ESRα loci in 96 infertile men aged 21～46 years（experimental group） and 83 normal healthy men aged 20～46 years （control group），and the method was verified by sequencing.In addition，distribution characteristics of genotype and allele frequency in the experimental group and the control group was counted by SPSS software.

Results Compared with wild homozygous genotype，heterozygous genotype and homozygous mutants genotype showed no correlation with male infertility，and it also showed no correlation in the comparison between mutant allele and wild allele（P>0.05）.Gene polymorphism of ESRα was not correlated with sperm concentration，the percentage of forward motile sperm and normal sperm morphology.

Conclusion Single nucleotide polymorphisms at the rs1062577 locus of ESRα is not correlated with male infertility in Zhuang nationality.

【Key words】 ESRα;male infertility;gene polymorphism;correlation analysis

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的標(biāo)準(zhǔn)，男性因素在降低人類生育能力中起著至關(guān)重要的作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體α（estrogen receptor α，ESRα）大量存在于人類生殖組織，其基因多態(tài)性與各種疾病，也包括有關(guān)人類不孕，在基因型和人類生殖行為之間表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用[2]。目前認(rèn)為造成男性不育最主要的因素為環(huán)境和遺傳因素，其中既常見又重要的因素是基因突變。因此研究參與男性精子發(fā)生基因的多態(tài)性成為該鄰域的研究熱點。本研究對ESRα基因rs1062577位點進(jìn)行基因多態(tài)性分析，闡述該位點基因多態(tài)性與廣西壯族男性不育之間的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016年10月至2017年3月就診于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心患者，此次研究對象均為廣西壯族男性，年齡21～46（31.05±5.83）歲，臨床表現(xiàn)為不育癥者96例，患者主訴婚后1年以上不育，有發(fā)育良好的第二性征和正常的睪丸體積，排除女方的因素。在進(jìn)行試驗組收集時，參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：精子密度的參考值下限為15×106/ml，總運動精子比例的參考值下限為40%，前向運動精子比例的參考值下限為32%，正常形態(tài)精子比例的參考值下限為4%;同時記錄患者年齡、民族、籍貫、生育史及家族史等基本情況。對照組為具有正常生育史的健康男性（83例），體格檢查和精液質(zhì)量分析均正常，排除炎癥、生殖系統(tǒng)器質(zhì)性病變等影響生育能力疾病的患者，年齡20～45（32.40±6.31）歲，本研究獲得右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過且患者知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 精液質(zhì)量檢測

所有檢測對象標(biāo)本采集時使用手淫取精法，取精前禁欲2～7天，收集于帶刻度的、清潔干燥試管內(nèi)，所有標(biāo)本均于本院取精室內(nèi)采取，確保送檢時間的可控性和及時性。接收時立即放入37℃恒溫箱內(nèi)，并記錄標(biāo)本采集時間。精液常規(guī)檢測采用西班牙SCA全自動精液分析系統(tǒng)，光學(xué)顯微鏡為OLYMPUS（日本，CX41-32C02），完成常規(guī)檢測后標(biāo)本進(jìn)行Diff-Quik快速染色（參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版診斷標(biāo)準(zhǔn)）[3]。

1.2.2 外周血 DNA的提取

采用EDTA-K2抗凝真空采血管抽取外周血3 ml，按照天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒說明書提取DNA，采用紫外分光光度儀檢測所提取的DNA濃度和純度，存放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ESRα基因分型檢測

PCR擴(kuò)增：總反應(yīng)體系體積20 μL，其中模板DNA 5 μL（終濃度1 μg/μL）、雙蒸水4.5 μL、基因分型混合物0.5 μL、FastStart Essential DNA探針預(yù)混物10 μL。應(yīng)用羅氏LightCycler 480實時熒光定量PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)孵育600 s;兩步放大：95℃ 15 s，60℃ 60 s（單次采集），共40個循環(huán);冷卻：37℃ 30 s，最后4℃保存;熒光通道為FAM/VIC。設(shè)置無模板質(zhì)控孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，對基因型和等位基因的頻率分布進(jìn)行χ2檢驗，計量資料若服從正態(tài)分布用（±s）表示，組間比較采用t檢驗或方差分析，若不服從正態(tài)分布，則用M（P₂₅，P₇₅）表示，組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗;基因多態(tài)性與男性不育的風(fēng)險關(guān)系采用比值比（odds radio，OR）及其95%可信區(qū)間（confidenceinterval，CI）來描述。使用在線分析工具計算試驗組和對照組哈德溫伯格平衡值（HWE），檢驗水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)? 果

2.1 群體代表性檢驗

對對照組基因型進(jìn)行哈德溫伯格平衡檢驗，P=0.139，說明研究對象來自同一群體，具有較好的代表性;年齡分布、禁欲時間和精液體積在兩組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組患者的前向運動精子百分率和精子濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。各項基本資料見表1。

2.2 ESRα rs1062577等位基因頻率和基因型分布

采用χ2 檢驗對ESRα rs1062577等位基因分布頻率和基因型頻率進(jìn)行分析，等位基因T、A分布頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。經(jīng)檢測該位點有三種基因型TT、AT、AA，其分布頻率在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

2.3 ESRα基因SNP 突變的測序分析

為進(jìn)一步驗證基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們隨機(jī)選取ESRα位點的三種基因型個體的樣本送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，測序結(jié)果與TaqMan探針方法得到的結(jié)果一致。詳細(xì)結(jié)果見圖1。

2.4 ESRα基因型間精液質(zhì)量的分析比較

采用多個樣本比較非參數(shù)Krukal-Wallis H檢驗不同基因型與精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果顯示，rs1062577位點三種基因型間（TT/AT/AA）精液體積、精子濃度、前向運動精子百分比及正常精子形態(tài)百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

3 討? 論

近年來的研究表明[4]，ESRα在精子發(fā)生的早期和生精細(xì)胞成熟的晚期發(fā)揮著生理功能，與精液質(zhì)量有著密切關(guān)系，其遺傳多態(tài)性影響疾病的發(fā)生發(fā)展，雌激素受體在生殖系統(tǒng)中的研究逐漸成為關(guān)注的焦點。雌激素一直被認(rèn)為是男性生殖的保護(hù)因子，但有研究表明[5～6]，雌激素減少可影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮，降低睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量，干擾胎兒睪丸間質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，調(diào)控生殖細(xì)胞的凋亡。E2通過ESRα信號能夠促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞畸形生長和巨噬細(xì)胞活化，刺激間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生生長停滯基因6（GAS6），連接細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸（PS），調(diào)節(jié)凋亡細(xì)胞的吞噬作用[7]。已有研究證實ESRα基因rs1062577位點與多種癌癥的易感性有關(guān)[8～9]，但其與男性不育的相關(guān)性鮮有報道。本研究結(jié)果顯示：ESRα基因rs1062577位點的等位基因頻率和基因型分布在試驗組和對照組之間沒有差異（P>0.05），由此可以推測ESRα基因rs1062577位點與廣西壯族男性不育不存在相關(guān)性。

雌激素受體激活細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)睪丸支持細(xì)胞增殖和分化，對建立血-睪屏障，維持精子發(fā)生的能力具有重要作用[10]。有學(xué)者推測[11]，ESRα基因發(fā)生突變可以使雌激素對生精細(xì)胞的作用減弱，可能是由于遺傳的連鎖不平衡效應(yīng)改變了基因的表達(dá)與功能，影響mRNA的合成、拼接、成熟、轉(zhuǎn)運、翻譯和降解過程，間接影響了精子發(fā)生。ESRα廣泛分布于雄性生殖系統(tǒng)內(nèi)，對生殖功能有一定影響，通過對ESRα敲除和敲入小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，主要通過配體依賴和非依賴途徑影響精子的發(fā)生和成熟，尤其是在輸出小管液體重吸收方面起到重要的調(diào)節(jié)作用[12]。已證實在使用ESRα激動劑治療后精子數(shù)目減少，這與ESRα激動劑能夠阻滯精子的變形，下調(diào)參與精子發(fā)生的基因有關(guān)[13]。Lazaros等[14]也發(fā)現(xiàn)，ESRα與精子發(fā)生過程和精子質(zhì)量有關(guān)，影響精子的動力和濃度。本研究中，ESRα rs1062577 位點基因多態(tài)性與精子濃度、前向運動精子百分比及正常精子形態(tài)百分比無相關(guān)性，可能是壯族與其他民族間存在差異，因而造成男性不育易感性差異[15]。

綜上所述，ESRα rs1062577與男性不育之間無關(guān)聯(lián)，但為廣西人群疾病遺傳多態(tài)性的研究提供參考資料。本研究僅收集廣西地區(qū)壯族為研究對象，且存在標(biāo)本量較少。因此，在研究的同時應(yīng)對本地區(qū)、不同種族進(jìn)行多位點、大樣本量的深入細(xì)致分析。

參 考 文 獻(xiàn)

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