微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展

崔強(qiáng)，趙治國，*，李菁雯，陳林軍，于志超，延涵，王海艷，李剛

（1.內(nèi)蒙古出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020；2.二連浩特出入境檢驗(yàn)檢疫局，內(nèi)蒙古二連浩特021600）

隨著我國科學(xué)技術(shù)水平的不斷進(jìn)步，經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)速度的加快，人們的生活水平也在大幅提高，人們?cè)谧⒅靥岣呱钏降耐瑫r(shí)，對(duì)食品質(zhì)量的要求也越來越高。食品質(zhì)量在人們生活中所占的比重在逐步增加。隨著質(zhì)量提升，打造質(zhì)量強(qiáng)國戰(zhàn)略的實(shí)施，食品行業(yè)在快速發(fā)展，規(guī)模也在不斷地?cái)U(kuò)大，而在發(fā)展過程中，食品安全問題也在逐年增加，尤其是食源性病原微生物的頻發(fā)，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到我國食品行業(yè)的發(fā)展。微生物檢驗(yàn)作為一項(xiàng)重要的技術(shù)手段，為保障食品安全提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。我國對(duì)于食品微生物的檢測(cè)和鑒定仍然停留在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鑒定和血清型等國標(biāo)描述的檢測(cè)方法上?，F(xiàn)有的檢測(cè)方法通常是培養(yǎng)法，但采用該方法也有很多的弊端，如檢測(cè)靈敏度不高，對(duì)目標(biāo)菌和雜菌的檢測(cè)容易漏檢，此外對(duì)于檢測(cè)結(jié)果中菌類計(jì)數(shù)會(huì)因不同檢測(cè)人員不同的計(jì)數(shù)方法會(huì)有差異。這些方法不僅需要時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣，而且特異性不強(qiáng)、靈敏度也不高。因此，從食品安全現(xiàn)狀和食品微生物檢測(cè)技術(shù)等關(guān)鍵問題出發(fā)，建立符合我國國情的食品安全檢測(cè)體系，從而有效地控制和預(yù)防食源性致病菌的傳播、發(fā)展。

食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用已成大勢(shì)所趨，尤其是食品安全檢測(cè)部門更加注重其發(fā)展?jié)撃?。食品微生物檢測(cè)方法為食品的安全提供強(qiáng)有力的科學(xué)依據(jù)。食品微生物的檢測(cè)關(guān)系著食品的安全，而食品安全又關(guān)系著人們的身體健康。因此，食品微生物檢測(cè)是關(guān)乎食品安全的關(guān)鍵因素。首先，食品微生物檢測(cè)是衡量食品衛(wèi)生與安全的重要指標(biāo)之一，也是判定被檢食品能否適用的科學(xué)依據(jù)之一。其次，通過食品微生物檢測(cè)，可以判斷食品加工環(huán)境及衛(wèi)生情況，對(duì)食品被致病微生物污染的程度作出正確的評(píng)價(jià)，為各項(xiàng)食品安全管理工作提供科學(xué)的依據(jù)。此外，食品微生物檢驗(yàn)是以貫徹“預(yù)防為主，防治為輔”的安全質(zhì)量方針，可以有效地預(yù)防或減少食物中毒和人畜共患病的發(fā)生；同時(shí)，它對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量，避免經(jīng)濟(jì)損失，保證出口等方面在政治和經(jīng)濟(jì)上都具有重大意義。

1 微生物檢測(cè)的常規(guī)方法

多年以來，對(duì)于食品中微生物的檢測(cè)通常采用國標(biāo)中的平板培養(yǎng)法，該方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)，而且容易造成結(jié)果數(shù)據(jù)的誤差，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。近幾年來，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)致力于快速檢測(cè)技術(shù)和方法的研究，以提高食品微生物檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，其中的常規(guī)新方法有以下幾種。

1.1 顯色培養(yǎng)基技術(shù)

顯色培養(yǎng)基微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)是指借助于微生物所對(duì)贏得種屬特異酶，在培養(yǎng)基中加入與之對(duì)應(yīng)的顯色酶，在微生物生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生酶，發(fā)揮對(duì)底物的水解效果，從而對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行著色，實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的準(zhǔn)確鑒定。法國研究人員于1974年首次開發(fā)顯色培養(yǎng)基，并將其應(yīng)用于對(duì)大腸桿菌的檢驗(yàn)中，后期應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，價(jià)值日益凸顯。顯色培養(yǎng)基現(xiàn)在已經(jīng)用于對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、志賀氏菌等快速檢測(cè)過程中，檢測(cè)人員可以根據(jù)不同菌群在不同的顯色培養(yǎng)基的顯色效果，可快速的檢測(cè)，判定該菌群種類。此外根據(jù)著色的差異還有快速紙片法，在金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等微生物的檢測(cè)中具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。

1.2 電阻抗法

電阻抗法是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)生物學(xué)技術(shù)。電阻抗法的技術(shù)原理是細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的過程中，導(dǎo)致培養(yǎng)基中大分子電惰性物質(zhì)如碳水化合物、蛋白質(zhì)等代謝為活性小分子物質(zhì)，從而增強(qiáng)瓊脂培養(yǎng)基的導(dǎo)電性，改變培養(yǎng)基的電阻抗，通過檢測(cè)電阻抗來判定培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖情況[1]判定細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)繁殖特性，即可檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)菌。目前，該方法已用于菌落總數(shù)、霉菌、酵母菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌等病原微生物的檢測(cè)[2]。

1.3 免疫磁珠的分離方法檢測(cè)

陽性分離法磁珠結(jié)合的細(xì)胞即為所要分離獲得的細(xì)胞，而陰性分離法磁珠結(jié)合不需要獲得的細(xì)胞，游離于磁場(chǎng)的細(xì)胞為所需細(xì)胞采用免疫磁珠的分離方式，將特異性抗體與磁珠顆粒的表面進(jìn)行關(guān)聯(lián)，可以將樣品中的微生物進(jìn)行特異性結(jié)合，通過外部磁場(chǎng)的作用，裝有病毒的微生物磁珠會(huì)在其作用之下向兩端靠攏，可以使微生物從樣品中分離出來。這種方法相對(duì)于普通檢測(cè)方法而言，可以在含有大量細(xì)菌的溶液中，具有選擇性的將微生物分離出來，具有較高的檢出效率[3]。一般來說陰性磁珠分離法比陽性分離法用的磁珠多，因此選擇陽性磁珠分離的方法較多。但該方法會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于細(xì)菌分離后的培養(yǎng)，而且成本較高，操作較為繁瑣，不利于在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的快速檢測(cè)。

1.4 納米裝置

納米裝置就是根據(jù)納米粒子的特性，把納米粒子用于標(biāo)記物檢測(cè)裝置。當(dāng)物體的尺度小到納米尺度時(shí)，就會(huì)表現(xiàn)出與宏觀尺度物質(zhì)不同的性能，因此稱為納米效應(yīng)。納米效應(yīng)可作為生物分析標(biāo)記物質(zhì)，能夠極大的改善標(biāo)記物性能，顯著提升靈敏度[4]。雖然此方法檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)靈敏度高、特異性較強(qiáng)，但是就目前檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的整體情況而言，該方法在應(yīng)用上還有較大的難度。

2 微生物檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)技術(shù)是一種現(xiàn)代新型的分子技術(shù)，在食品微生物檢測(cè)過程中，主要是在分子水平上分析微生物的線性結(jié)構(gòu)來認(rèn)知樣本中的微生物類型，其主要優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)、靈敏度高。Liustratton Y等[5]證實(shí)分子生物學(xué)技術(shù)在食品檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，分子生物學(xué)檢測(cè)與基因的表達(dá)對(duì)食品檢測(cè)具有重要意義。

2.1 可視化基因芯片技術(shù)

基因芯片以其靈敏度高、高通量的特點(diǎn)逐漸成為致病微生物檢測(cè)研究的熱點(diǎn)，對(duì)于普通的基因芯片在雜交反應(yīng)結(jié)束后還需使用熒光掃描顯微鏡對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，給實(shí)驗(yàn)室在使用上造成了一定的困難。為了解決基因芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果處理與分析的難題，進(jìn)而開發(fā)了一種新的芯片技術(shù)——可視化基因芯片技術(shù)。Ostroff等[6]證實(shí)酶在催化作用下產(chǎn)生沉淀，并沉積于基因芯片表面，使基因芯片的厚度發(fā)生明顯的變化，導(dǎo)致反射在基因芯片上光的波長(zhǎng)發(fā)生實(shí)質(zhì)改變，通過基因芯片上顏色的變化來觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。可視化基因芯片技術(shù)檢測(cè)效率高，操作方便快捷，能夠在較短時(shí)間內(nèi)得出檢測(cè)結(jié)果，雖然一次可視芯片技術(shù)檢測(cè)能夠檢測(cè)出多種潛在致病菌，但是由于可視化基因芯片檢測(cè)技術(shù)成本較高，操作要求比較繁瑣，因此，目前還沒有在食品安全領(lǐng)域有較大的推廣[7]。

2.2 熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)

熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)是根據(jù)噬菌體特異性侵染宿主菌的原理，選用合適的染色劑將噬菌體的核酸進(jìn)行染色標(biāo)記，然后用標(biāo)記過的噬菌體侵染相應(yīng)的宿主菌，噬菌體吸附在其宿主菌表面后，隨即將標(biāo)記過的核酸注入宿主細(xì)胞，隨著越來越多的噬菌體核酸的注入，細(xì)胞內(nèi)熒光隨著熒光素的增多而增強(qiáng)，借助熒光顯微鏡便能判定宿主菌的存在，從而實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測(cè)[8]。Mosier-boss等[9]在前人的基礎(chǔ)上，將熒光染料YOYO-1更換為靈敏度較高，且對(duì)噬菌體結(jié)構(gòu)和功能都無破壞性的SYBR gold核酸染料標(biāo)記沙門氏菌噬菌體P22，成功的檢測(cè)到了沙門氏菌LT2株，同時(shí)與核酸染料作對(duì)比，結(jié)果顯示SYBR gold染劑是實(shí)驗(yàn)效果最好的核酸染料；Phea M H等[10]與Flajshans M等[11]分別將SYBR greenⅠ和SYBR greenⅡ用于大腸桿菌、沙門氏菌、以及李斯特菌的檢測(cè)，均已成功檢出，且靈敏度較高，特異性強(qiáng)，該方法完全可以用于實(shí)際生產(chǎn)中微生物的檢測(cè)。多數(shù)噬菌體與宿主呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，雖特異性極高，但宿主范圍較窄，且噬菌體與宿主作用的裂解機(jī)理尚不明確，有待進(jìn)一步研究，所以該技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用相對(duì)較少。但是熒光標(biāo)記噬菌體技術(shù)，檢測(cè)周期短，能區(qū)分死活細(xì)菌，準(zhǔn)確性好，檢測(cè)前無需將細(xì)菌純化，預(yù)增菌后即可用于檢測(cè)，整個(gè)過程可在8小時(shí)內(nèi)結(jié)束，且可以對(duì)多個(gè)細(xì)菌進(jìn)行同步檢測(cè)，因此該項(xiàng)技術(shù)在食源性致病菌的檢測(cè)中有著廣闊的發(fā)展前景。

2.3 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）

熒光定量PCR技術(shù)是1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新的定量檢測(cè)技術(shù)，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記，使用熒光定量PCR儀對(duì)圖示結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)算出待檢樣品的初始濃度[12]。Cheng等[13]利用設(shè)計(jì)的引物和探針檢測(cè)沙門氏菌的262 bp基因片段，Bialek H等[14]熒光定量PCR-探針法分析藥物分子含量。熒光定量PCR技術(shù)根據(jù)已知細(xì)菌的遺傳信息，設(shè)計(jì)特定的引物探針擴(kuò)增序列，根據(jù)是否有特定長(zhǎng)度擴(kuò)增產(chǎn)物的出現(xiàn)判斷是否存在檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)菌[15]。此方法用于微生物及病原菌毒素檢測(cè)具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[16]。此外熒光定量PCR技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多通道，多項(xiàng)目的檢測(cè)，在食品微生物致病菌的檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用。

2.4 基因探針技術(shù)

生物技術(shù)用于食品檢測(cè)是十分常見的技術(shù)手段，尤其是一些富含大量微生物的食品，如在酸奶、乳酸菌飲料中含有大量對(duì)人體有益的菌類，如何正確的區(qū)分有益菌和致病菌，只有依靠生物技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)?；蛱结樇夹g(shù)在這一點(diǎn)上表現(xiàn)得十分出色，能準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的菌類[17]?；蛱结樇夹g(shù)是用一段已知基因的核酸序列作為探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，若兩者的堿基完全配對(duì)，可互補(bǔ)結(jié)合成雙鏈，從而表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。該技術(shù)具有特殊性強(qiáng)、靈活性高和操縱便捷、省時(shí)等優(yōu)勢(shì)。但該技術(shù)也有局限性，主要體現(xiàn)在成本高等方面。

2.5 微滴數(shù)字PCR技術(shù)

微滴式數(shù)字PCR技術(shù)（micro drop digital polymerase chain reaction，ddPCR），微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增前是將一個(gè)大的反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用油包水技術(shù)將其“分割”為數(shù)萬個(gè)納升級(jí)的微滴[18]，每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或含有至少一個(gè)待檢核酸靶分子，并且每個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系。根據(jù)陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例，利用泊松分布原理得出靶分子的起始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)最初反應(yīng)體系中核酸靶分子數(shù)的絕對(duì)定量[19]。該方法在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進(jìn)行有效分割，通過PCR擴(kuò)增和熒光信號(hào)的積累讀取陽性反應(yīng)單元數(shù)，計(jì)算出檢測(cè)樣本的DNA分子數(shù)目[20]。由于ddPCR技術(shù)降低了對(duì)反應(yīng)擴(kuò)增效率的要求，可以有效的勝任許多稀有變異的檢測(cè)工作。ddPCR技術(shù)采用一種全新的方式進(jìn)行核酸分子的定量，與傳統(tǒng)的普通PCR和熒光定量PCR相比，其結(jié)果的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度更佳。ddPCR技術(shù)比傳統(tǒng)的熒光定量PCR方法更加的準(zhǔn)確，特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，能夠做到絕對(duì)定量。該技術(shù)在微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、地溝油檢測(cè)、動(dòng)物疫病檢測(cè)、疾病檢測(cè)以及質(zhì)檢領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中已凸顯優(yōu)勢(shì)，隨著微滴數(shù)字PCR儀的普及應(yīng)用，該技術(shù)必將被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

2.6 疊氮溴化乙錠-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ethidium monoazide bromide-polymerase chain reaction，EMAPCR）檢測(cè)技術(shù)

將EMA與熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合，能夠有效、快速的檢測(cè)出食品中的食源性致病菌，而且EMA作為DNA結(jié)合染料，能夠快速滲透細(xì)胞壁，穿透細(xì)菌的細(xì)胞膜從而進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)。通常死細(xì)胞的細(xì)胞膜已遭到破壞，EMA很容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部插入到細(xì)胞內(nèi)DNA雙螺旋上。但活菌的細(xì)胞膜比較完整，EMA不能滲透到活細(xì)胞內(nèi)。選用一定濃度比例的EMA與菌液結(jié)合，經(jīng)過高強(qiáng)度的鎢燈照射處理后，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價(jià)交叉偶合，且這種共價(jià)偶合具有不可逆性，抑制后續(xù)PCR擴(kuò)增中引物與死菌DNA的結(jié)合，從而達(dá)到區(qū)分死活菌的目的[21]。此方法的建立能夠快速、準(zhǔn)確的區(qū)分、鑒定死菌和活菌，與普通PCR方法比較，大大的降低了假陽性結(jié)果。該方法具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)周期短、靈敏度高等特點(diǎn)，在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。

3 結(jié)論與展望

從分子學(xué)角度來看，微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展從普通的培養(yǎng)基培養(yǎng)法，再到后來的PCR技術(shù)、熒光定量PCR方法和絕對(duì)定量PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了微生物檢測(cè)從定性到絕對(duì)定量的質(zhì)的發(fā)展。微滴式數(shù)字PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的絕對(duì)定量技術(shù)，該方法是在PCR擴(kuò)增前將含有核酸分子的反應(yīng)體系進(jìn)行有效分割，微滴式數(shù)字PCR技術(shù)的定量檢測(cè)限比傳統(tǒng)PCR技術(shù)低，特異性和重復(fù)性和傳統(tǒng)定量PCR也存在極大的優(yōu)勢(shì)。鑒于這種微滴反應(yīng)能極大程度分散反應(yīng)體系，可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測(cè)過程中的擴(kuò)增效率，對(duì)檢測(cè)低含量目標(biāo)核酸分子的樣品有良好的效果[22]。因此，在今后的微生物檢測(cè)與研究中，可將EMA與微滴式數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合，用于活體微生物的檢測(cè)，運(yùn)用其絕對(duì)定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用在日常的微生物檢測(cè)過程，其與常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)相比最大的不同就是當(dāng)檢測(cè)相同樣品數(shù)量時(shí)，運(yùn)用EMA與微滴式數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)的時(shí)間短、靈敏度高、而且能夠做到絕對(duì)定量。

食品安全問題與人們的生命健康緊密相關(guān)，分子生物學(xué)技術(shù)能夠快速、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)食品微生物數(shù)量和種類，是評(píng)價(jià)食品是否合格的重要標(biāo)志之一，對(duì)促進(jìn)食品行業(yè)的快速發(fā)展，提升食品安全質(zhì)量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此在今后的社會(huì)發(fā)展中要加大對(duì)食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的投入，使食品質(zhì)量更加安全可靠。運(yùn)用簡(jiǎn)便、快捷的分子生物學(xué)方法不僅可以在食品微生物檢測(cè)過程中提高檢出率，而且在人畜共患病的診斷等方面前景更加廣泛。