結(jié)直腸癌中miR—106b增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放療抵抗作用機(jī)制的初步分析

楊麗君 萬(wàn)曉晨

[摘要] 目的 探討結(jié)直腸癌中miR-106b增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞放療抵抗作用機(jī)制。 方法 采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞株當(dāng)中的miR-106b的表達(dá)，分析其對(duì)放療抵抗的影響。 結(jié)果 檢測(cè)SW620細(xì)胞放療敏感性，miR-106b過(guò)表達(dá)之后SW620細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；檢測(cè)miR-106b抑制表達(dá)的SW480細(xì)胞放療敏感性，miR-106b穩(wěn)定干擾之后SW480細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)要顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SW620/plVTHM/miR-106b細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于SW620/plVTHM細(xì)胞（P<0.05）。 結(jié)論 miR-106b可以強(qiáng)化細(xì)胞抵抗射線(xiàn)導(dǎo)致的DNA損傷，提高細(xì)胞修復(fù)DNA的能力，最終強(qiáng)化結(jié)直腸癌細(xì)胞放療抵抗作用。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；miR-106b；腫瘤細(xì)胞；放療抵抗；機(jī)制

[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.34 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）01-0029-03

Preliminary analysis on the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer

YANG Lijun WAN Xiaochen

Clinical Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of miR-106b enhancing the radioresistance of tumor cells in colorectal cancer. Methods The expression of miR-106b in colorectal cancer cell lines was detected by RT-PCR. Its impact on radioresistance was analyzed. Results The radiosensitivity of SW620 cells was detected. The survival score of SW620 cells after miR-106b overexpression was significantly higher than that in the control group（P<0.05）； the radiosensitivity of miR-106b to inhibit the expression of SW480 cells was detected， and the survival score of SW480 cells after miR-106b stable interference was significantly lower than that in the control group（P<0.05）； the results of plate cloning experiments showed that the cell proliferation of SW620/plVTHM/miR-106b cells was significantly stronger than that of SW620/plVTHM cells（P<0.05）. Conclusion miR-106b can enhance the cell resistance to radiation-induced DNA damage， improve the ability of cells repairing DNA， and ultimately enhance the radioresistance of colorectal cancer cells.

[Key words] Colorectal cancer； miR-106b； Tumor cells； Radioresistance； Mechanism

結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展同遺傳因素以及環(huán)境因素等存在密切聯(lián)系，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌臨床發(fā)病率近年來(lái)呈現(xiàn)出明顯升高的發(fā)展趨勢(shì)。當(dāng)前情況下，結(jié)直腸癌患者的治療主要是手術(shù)治療聯(lián)合輔助放療[1]。有效放療可以殺死癌癥細(xì)胞，同時(shí)延長(zhǎng)細(xì)胞周期，改善手術(shù)治療效果。不過(guò)部分患者的放療敏感性比較低，遠(yuǎn)期效果不夠理想，因此放療抵抗作用機(jī)制成為結(jié)直腸癌研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題[2]。本文研究結(jié)直腸癌細(xì)胞株當(dāng)中的miR-106b表達(dá)，探討其同放療抵抗之間的聯(lián)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480及SW620，動(dòng)物小鼠購(gòu)自省動(dòng)物中心， 3～6周齡，雌雄各半，體重（20±2）g。恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)，確保無(wú)特定病原體。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法 SW480及SW620借助于慢病毒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)或者是干擾細(xì)胞株的培養(yǎng)箱當(dāng)中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)定溫度37℃，5%的CO2，細(xì)胞應(yīng)用10%的牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基，添加50 U/mL青霉素，50 mg/mL的鏈霉素，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，應(yīng)用0.5%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，選取處于指數(shù)生長(zhǎng)階段的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[3]。

1.2.2 配置試劑 細(xì)菌培養(yǎng)基的配制方面，LB液體培養(yǎng)基，主要成分為5.0 g的胰蛋白胨、10.0 g的酵母提取物、5.0 g的氯化鈉，添加500 mL去離子水之后攪拌，pH值升高至7.0，分裝之后高壓滅菌儲(chǔ)存[4]。添加抗生素當(dāng)作培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)基方面，在液體培養(yǎng)基當(dāng)中添加2.5%的瓊脂粉，在高壓滅菌之后冷卻，混勻之后每個(gè)平板倒入20 mL的培養(yǎng)基，常溫條件下冷卻到凝固并且使用保鮮膜進(jìn)行封裝[5]。

1.2.3 細(xì)胞輻射處理及檢測(cè) 使用5%的胰酶消化細(xì)胞制作得到單細(xì)胞懸液，分析細(xì)胞的濃度，接種到6孔板，在培養(yǎng)箱當(dāng)中持續(xù)孵育9 h之后，應(yīng)用Varian 2300加速器進(jìn)行6MV-X線(xiàn)照射，其中劑量率是2 Gy/min，細(xì)胞覆蓋1 cm玻璃，完成劑量建成之后終止培養(yǎng)，并且吸去培養(yǎng)液。每孔當(dāng)中添加150 μL的DMSO持續(xù)振蕩5 min之后檢測(cè)OD490 nm位置的具體數(shù)值[6]。

1.2.4 細(xì)胞輻射之后檢測(cè)對(duì)克隆的影響 兩組細(xì)胞接種到6孔板中，每組分成0 Gy、l Gy、2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy等不同的劑量，每個(gè)劑量組設(shè)置3個(gè)不同的復(fù)孔[7]。照射之后的細(xì)胞置于常溫條件下持續(xù)培養(yǎng)2周，期間根據(jù)pH值情況更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)板孔當(dāng)中發(fā)現(xiàn)肉眼能夠發(fā)現(xiàn)的克隆之后停止培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液之后PBS清洗細(xì)胞反復(fù)沖洗[8]。應(yīng)用甲醇持續(xù)固定，之后去除甲醛，應(yīng)用1%的結(jié)晶紫乙醇溶液進(jìn)行染色，洗去染液之后干燥，并應(yīng)用顯微鏡統(tǒng)計(jì)50個(gè)以上的克隆，從而計(jì)算克隆率（克隆數(shù)/細(xì)胞數(shù)×100%）及存活分?jǐn)?shù)（受照射細(xì)胞克隆率/對(duì)照細(xì)胞克隆率×100%）。將3次照射得到的存活分?jǐn)?shù)平均值當(dāng)作結(jié)果[9]。

1.2.5 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)0 Gy或者是2 Gy照射之后24 h及48 h后收集細(xì)胞，使用PBS反復(fù)洗3遍，3000 r/min持續(xù)離心10 min，細(xì)胞沉淀儲(chǔ)存到離心管當(dāng)中，吸凈上清之后使用振蕩器充分震蕩，添加l mL的冰乙醇，次日離心去除上清并應(yīng)用PBS反復(fù)沖洗，添加50 μL的PBS及100 μg/mL RNA酶，在常溫條件下水浴1 h，染色之后使用100目的尼龍網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，應(yīng)用細(xì)胞儀分析各個(gè)細(xì)胞時(shí)相占據(jù)的百分比[10]。

1.2.6 放療敏感性 將兩組細(xì)胞制作成為單細(xì)胞懸液，使用1640培養(yǎng)基確定細(xì)胞的濃度為1×106/mL。在小鼠皮下接種0.1 mL的細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)過(guò)程當(dāng)中每3天使用游標(biāo)卡尺來(lái)確定腫瘤最大徑及垂直橫徑，腫瘤體積約為200 mm3之后應(yīng)用8 GyX線(xiàn)進(jìn)行照射。每組4只用來(lái)計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（1-實(shí)驗(yàn)組體積/對(duì)照組體積）×100%[11]。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣本均數(shù)對(duì)比應(yīng)用隨機(jī)設(shè)計(jì)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106b轉(zhuǎn)染SW620細(xì)胞放療后增殖能力對(duì)比

檢測(cè)SW620細(xì)胞放療敏感性，miR-106b過(guò)表達(dá)之后SW620細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2穩(wěn)定干擾miR-106b表達(dá)放療處理后SW480細(xì)胞放療敏感性對(duì)比

檢測(cè)miR-106b抑制表達(dá)的SW480細(xì)胞放療敏感性，miR-106b穩(wěn)定干擾之后SW480細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)要顯著低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表2。

2.3 SW620 miR-106b過(guò)表達(dá)前后克隆形成率及存活分?jǐn)?shù)對(duì)比

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SW620/plVTHM/miR-106b細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于SW620/plVTHM細(xì)胞（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

隨著我國(guó)居民物質(zhì)生活的改善，結(jié)直腸癌的臨床發(fā)病率日益上升，且患者的病死率較高。研究人員從miRNAs及生物標(biāo)志分子等不同領(lǐng)域探索直腸癌放療抵抗作用機(jī)制，結(jié)果提示不同層面的分子機(jī)制存在明顯的區(qū)別，且互相存在影響。腫瘤干細(xì)胞及放療抵抗之間的聯(lián)系受到研究人員的重視[12]。有研究表明miRNAs影響到生命過(guò)程的各個(gè)環(huán)節(jié)，如發(fā)育、細(xì)胞代謝、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞分化等，通過(guò)這一途徑影響到免疫功能[13]。miR-106b長(zhǎng)度為2 Int，位置在染色體7q22-1，所屬的基因簇較為保守，主要以多順?lè)醋有问焦餐D(zhuǎn)錄，其平行表達(dá)在肝、胃及前列腺等腫瘤當(dāng)中都表現(xiàn)得較為明顯[14]。研究人員借助于基因芯片發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌當(dāng)中miR-106b表達(dá)要顯著高于附近的健康組織，miR-106b一方面在腫瘤病變位置的表達(dá)異常，另一方面在循環(huán)系統(tǒng)血液當(dāng)中的表達(dá)同樣顯著上升，在結(jié)直腸癌患者血液當(dāng)中的miR-106b的水平要顯著高于健康人群[15]。這提示miR-106b對(duì)腫瘤增殖環(huán)節(jié)有重要影響，不過(guò)在腫瘤放療環(huán)節(jié)當(dāng)中的影響還缺乏相關(guān)的研究。本研究檢測(cè)SW620細(xì)胞放療敏感性，結(jié)果顯示miR-106b過(guò)表達(dá)之后SW620細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。

有研究人員發(fā)現(xiàn)miR-106b在刺激腫瘤增殖環(huán)節(jié)，可以加速結(jié)直腸癌從G1期向S期的過(guò)渡，而G1期及S期是放療的敏感期及抵抗期[16]。通常情況下，高分化腫瘤對(duì)放療的敏感性比較差，低分化腫瘤細(xì)胞的放療敏感程度較高，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)高分化細(xì)胞株SW480的放療敏感性比較差，而低分化細(xì)胞株SW620對(duì)于放射治療仍然較為敏感[17]。本研究中，高分化細(xì)胞株（SW480）當(dāng)中的miR-106b表達(dá)要顯著高于低分化的細(xì)胞株（SW620），并且表達(dá)水平同放療敏感性存在顯著相關(guān)性。借助于一系列實(shí)驗(yàn)，如平板克隆實(shí)驗(yàn)、體外增殖實(shí)驗(yàn)等，我們發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的SW620細(xì)胞對(duì)放療作用仍然有著比較強(qiáng)的敏感性，過(guò)表達(dá)的SW620對(duì)放療抵抗的作用較為明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-106b可以借助于強(qiáng)化結(jié)直腸癌細(xì)胞抗凋亡的能力，來(lái)加速細(xì)胞G1/S期的過(guò)渡，從而強(qiáng)化放療抵抗作用。

本研究中，檢測(cè)miR-106b抑制表達(dá)的SW480細(xì)胞放療敏感性，miR-106b穩(wěn)定干擾之后SW480細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)要顯著低于對(duì)照組（P<0.05），同時(shí)平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SW620/plVTHM/miR-106b細(xì)胞增殖能力顯著強(qiáng)于SW620/plVTHM細(xì)胞（P<0.05）。這提示miR-106b可以增強(qiáng)細(xì)胞抵抗射線(xiàn)導(dǎo)致的DNA損傷，強(qiáng)化細(xì)胞DNA損傷之后的自我修復(fù)功能，通過(guò)這一途徑強(qiáng)化細(xì)胞放療抵抗作用[18]。簡(jiǎn)言之，隨著腫瘤免疫學(xué)、分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程等學(xué)科的進(jìn)步，靶向治療的臨床應(yīng)用日益廣泛，為逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌患者的放療抵抗作用提供了新思路，少數(shù)新藥開(kāi)發(fā)及具體應(yīng)用的效果良好[19]。隨著醫(yī)學(xué)研究的持續(xù)深入，相信通過(guò)深入分析結(jié)直腸癌患者的放療抵抗作用機(jī)制，同靶向藥物的研究相結(jié)合，將進(jìn)一步改善結(jié)直腸癌輔助放療的效果[20]。

綜上所述，miR-106b可以強(qiáng)化細(xì)胞抵抗射線(xiàn)導(dǎo)致的DNA損傷，提高細(xì)胞修復(fù)DNA的能力，最終強(qiáng)化結(jié)直腸癌細(xì)胞放療抵抗作用。

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（收稿日期：2017-10-25）