九肽—1純化方法研究

蘇晨燦　張忠旗　趙金禮等

摘要：本研究運用高效液相色譜，通過對九肽-1粗品采用反相聚合色譜柱分離純化、DEAE柱脫除三氟乙酸，獲得了九肽-1純品，結(jié)果表明，所得九肽-1收率為79%，純度高于99%。

關鍵詞：九肽-1；高效液相色譜；純化；離子交換

OOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.02.175

九勝肽1又名美立肽，為含有九個氨基酸的美白九肽，主要用于美白亮膚及祛斑。九肽1是一種仿生肽，它和黑色素細胞上的MCl受體有非常好的匹配性，因此可以作為促黑色素細胞激素的對抗劑，競爭性的與MCl受體結(jié)合，阻止酪氨酸酶進一步被激活而產(chǎn)生黑色素。九肽1競爭性的封閉黑素母細胞上受體與各種因子信號的入口，弱化了黑素母細胞的活性，減少黑素產(chǎn)生量，14天開始逐步均勻膚色，一個皮膚周期28天后，明顯提亮膚色，呈現(xiàn)肌膚紅潤、白皙，因此九肽-1常被用作化妝品原料。

九肽1作為化妝品原料時HPLC純度≥99%，然而通過合成得到的九肽-1粗品中含有很多雜質(zhì)，需要進一步提純后才可以作為化妝品原料。

1實驗部分

1.1試劑與儀器

乙酸（分析純天津市福晨化學試劑廠提供）、氫氧化鈉（分析純天津市紅巖化學試劑廠）、乙酸鈉（分析純天津市天力化學試劑有限公司）、氯化鈉（分析純國藥集團化學試劑有限公司）甲醇（色譜純宿松龍華精細化工有限公司）、乙腈（色譜純TEDIA COMPANYINC.）、三氟乙酸（色譜純TEDIA COMPANY INC.）、微孔濾膜（0.45μm上海市新亞凈化器件廠）、九勝肽1粗品（陜西慧康生物科技有限責任公司固相合成）、超純水。

制備高效液相色譜儀（創(chuàng)新通恒LC3000）、分析高效液相色譜儀（日立全自動L2000系列）、C18分析色譜柱（大連物理化學研究所4.6mm×250mm）、反相聚合物柱（自填體積為300mL成都科譜生物有限公司填料F型粒徑為30～50}μn的SBC MCI GEI反相色譜填料由提供）、純水機（北京愛思特克科技開發(fā)有限責任公司CSR-4-10）、超聲波清洗器（昆山市儀器有限公司KQ-500B）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠RE-52AA）、冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司FD-1C-50）、循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司SHB-Ⅲ）、雙級旋片式真空泵（上海河山泵業(yè)有限公司2XZ-4）。

1.2實驗過程

（1）樣品溶解。將九勝肽-1粗品溶解于水溶液中，超聲分散，用濾膜過濾，收集濾液；

（2）粗品分析及程序優(yōu)化。取1.2.1所得濾液0.1mL用水溶液稀釋至1mL，用C18分析柱進行分析。

分析及程序優(yōu)化條件：流動相：A相為體積比0.1%三氟乙酸/水；B相為體積比0.1%三氟乙酸/乙腈；檢測波長：215nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL；洗脫時間：30min；洗脫梯度：B相濃度從10%-90%；根據(jù)粗品分析所得結(jié)果進行程序優(yōu)化：洗脫梯度從B相濃度10%-90%逐步優(yōu)化至25%-55%。

（3）純化。以優(yōu)化程序為參考用反相聚合物制備柱對過濾后的九勝肽-1粗肽溶液進行純化。

純化條件：流動相：A相為體積比0.1%三氟乙酸/水B相為體積比0.1%三氟乙酸/甲醇；檢測波長：215nm；流速：20.0mL/min；進樣量：10mL；洗脫時間：50min；洗脫梯度：B相濃度45%-60%；收集目標物餾分并進行分析，分析條件同粗品分析，洗脫梯度：B相濃度25%55%，將純度>99%的餾分合并，減壓蒸餾濃縮，待用。

（4）除三氟乙酸。將純化后的濃縮液使用DEAE弱陰離子交換柱脫除三氟乙酸。

除三氟乙酸條：流動相：A相為2%醋酸；檢測波長215nm；流速：8.0mL/min；洗脫時間：50min；洗脫梯度：100%A相等度洗脫；收集目標物餾分，減壓蒸餾濃縮，待用。

（5）成骨五勝肽純品分析及質(zhì)譜確認。將1mg九肽-1純品凍干粉溶解于1mL水溶液中。分析條件同粗品分析，洗脫梯度：B相濃度25%-55%。取1mg九肽-1純品送第四軍醫(yī)大學進行質(zhì)譜測定。

2結(jié)果與討論

2.1粗品分析及程序優(yōu)化

九肽1粗品分析及程序優(yōu)化圖如圖1所示，其中圖1為根據(jù)粗品保留時間、純度及峰型，進行三次程序優(yōu)化后得到的分析圖：分析程序優(yōu)化到洗脫梯度B相濃度25%-55%時，粗品中所含雜質(zhì)峰與目標物明顯分離開來，該程序可以為純化提供參考。

2.2純化

九肽1純化后的分析圖如圖2所示，B相濃度45%-60%進行純化時，雜質(zhì)峰完全分離，且純化后目標物純度>99.0%。實驗證明該純化條件用于九肽1粗品純化具有很好的適用性。

2.3凍干粉純度分析

凍干后稱得九肽-1純品，純化收率為79%。其中圖3為九肽-1純品凍干后的色譜表征圖，純度為99%。

3結(jié)論

本方法打破了直接運用反相高效液相色譜法進行反復純化的傳統(tǒng)多肽純化方法，將反相聚合物柱與弱陰離子交換柱結(jié)合使用，先對九肽-1進行粗純，除去了大部分雜質(zhì)，再用弱陰離子交換柱進行脫鹽，將三氟乙酸型九肽-1轉(zhuǎn)換成醋酸型九肽-1，并進一步純化了多肽，極大地提高了純化效率，節(jié)省了整個純化過程中流動相的成本，且純化工藝較為環(huán)保。本方法粗純過程中使用三氟乙酸水溶液和三氟乙酸甲醇溶液做流動相，甲醇用量少且價格低廉，對環(huán)境污染小，兩種柱子交替使用，有效地彌補了單一柱子難以完全分離粗肽中不同結(jié)構(gòu)、不同化學性質(zhì)的雜質(zhì)，得到的九肽-1純度高（大于99%），且收率高。