LY294002通過PI3K/Akt/mTOR對(duì)CD133+CD44+結(jié)直腸癌干細(xì)胞自我更新、增殖能力的影響

伊紀(jì)瑛，唐晨曦，章淑芳，李孝瓊，陳政儒，李佳麗，夏金蓉，李思宇，冷政偉

(1.南充市中心醫(yī)院腫瘤科；2.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸疾病研究所，四川 南充 637000)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中排名第五；在美國已躍居第三，居消化系統(tǒng)腫瘤第一位；CRC患者中40%～50%在初診時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使接受了根治性手術(shù)切除和規(guī)范放化療，最終仍然有50%以上轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是CRC的主要死因[1-2]。研究證實(shí)，能夠耐受治療的細(xì)胞由腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)組成，CSCs數(shù)量十分稀少甚至無法檢測(cè)，但其強(qiáng)大的自我更新、增殖能力最終介導(dǎo)了腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，因此，CSCs已經(jīng)成為探索治療腫瘤最重要的靶點(diǎn)之一[3-5]?？茖W(xué)家主要通過標(biāo)記CD133、CD44、CD166、EpCAM、Lgr5、ALDH、SP等標(biāo)識(shí)來分析分選CRC-CSCs[6]。PI3K/Akt/mTOR通路激活后具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡、促進(jìn)血管生成及轉(zhuǎn)移作用，已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，但PI3K/Akt/mTOR通路在維持CRC-CSCs自我更新、增殖過程中的作用未見報(bào)道。本課題首先分選CD133+CD44+的CRC-CSCs，將PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑作用于CSCs，以研究此通路在人CRC-CSCs自我更新、增殖過程中的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞系、McCoy’s 5A培養(yǎng)基均購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；胎牛血清(FBS)及DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；LY394002、牛血清白蛋白(BSA)、7-AAD、B27及胰島素購自美國Sigma公司；人表皮細(xì)胞生長因子(EGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)購自美國Pepro-Tech公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁化工公司；PI3K/Akt/mTOR通路一抗及二抗均購自美國Santa Cruz公司；CD133-PE及CD44-FITC流式細(xì)胞術(shù)(FCM)抗體及相關(guān)試劑購自德國美天妮公司；轉(zhuǎn)錄因子流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司。

1.2 結(jié)直腸癌CD133+CD44+腫瘤干細(xì)胞分選

人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞用含10% FBS的McCoy’s 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。常規(guī)消化細(xì)胞，懸浮1×106細(xì)胞于100 μL 緩沖液中，分別加入3 μL CD133-PE及CD44-FITC抗體，4 ℃避光孵育30min，上機(jī)前7-AAD室溫孵育10min以利分選時(shí)去除死細(xì)胞，然后上機(jī)分選(BD FACSAria Fusion)，分選獲得CD133+CD44+及CD133-CD44-細(xì)胞，細(xì)胞分別培養(yǎng)于含20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、5 μg/mL 胰島素、0.4% BSA及2% B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中，然后進(jìn)行CD133+CD44+細(xì)胞CSCs特征鑒定，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞活性計(jì)數(shù)法檢測(cè)LY294002對(duì)CSCs增殖能力的影響

細(xì)胞活性計(jì)數(shù)法(CCK-8)：取5×103細(xì)胞/孔接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)組用LY294002(10、20、30 μmol/L)、對(duì)照組不使用LY294002，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后加入CCK-8試劑，在450 nm波長處讀吸光度值(OD)，繪制生長曲線，抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%)。

1.4 成球?qū)嶒?yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)及平板克隆實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)流程參考本課題組發(fā)表論文[7]，成球?qū)嶒?yàn)及平板克隆實(shí)驗(yàn)中接種5×103細(xì)胞于相應(yīng)6孔板中，2周后收集數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 有限濃度稀釋法

細(xì)胞以每孔不同濃度(0.5、1、1.5、2個(gè)細(xì)胞/孔)接種于96孔板中培養(yǎng)2 周后記錄每孔中細(xì)胞球數(shù)量，陰性孔比例與細(xì)胞稀釋濃度作圖并進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算CSCs比例[8]。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表達(dá)

實(shí)驗(yàn)步驟參考課題組發(fā)表論文[7]，引物序列如下：

GAPDH-F：5′-GGGGAGCCAAAAGGGTCATCATCT-3′，

GAPDH-R：5′ GACGCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′；

CyclinD1-F：5′-TACCGCACAACGCACTTTC-3′，

CyclinD1-R：5′-AAGGGCTTCAATCTGTTCCTG-3′；

mTOR-F：5′-CGCTGCCCCTTTATCG-3′，

mTOR-R：5′-GGTGGAGGTGTTTGAGCAT-3′；

Bcl-2-F：5′-GTGAGAAGTGAGGGACCTTTATG-3′，

Bcl-2-R：5′-CACTCATTAGCCATATCCAACTTG-3′；

DcR3-F：5′-TTCTGCTTGGAGCACGCATCG-3′，

DcR3-R：5′-ACGCAGCTTCAGCTGCAAGG-3′。

1.7 FCM檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR通路蛋白質(zhì)表達(dá)

按照BD流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)試劑盒說明書在室溫下作用40 min以固定及通透3×105細(xì)胞，1/100稀釋的一抗在4 ℃避光作用4 h，漂洗后以1/100稀釋的熒光素標(biāo)記二抗37 ℃作用30 min，不加一抗只加入二抗組設(shè)置為流式細(xì)胞術(shù)同型對(duì)照，漂洗后細(xì)胞懸浮于200 μL 孵育液中上機(jī)檢測(cè)。FCM數(shù)據(jù)采用FlowJo version 10.0分析，蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量多少由熒光強(qiáng)度比(RFI)大小表示，RFI=樣本平均熒光強(qiáng)度/同型對(duì)照平均熒光強(qiáng)度[9-10]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CD133+CD44+腫瘤干細(xì)胞特征的鑒定

成球?qū)嶒?yàn)是CSCs體外鑒定的一個(gè)重要方法，檢測(cè)細(xì)胞自我更新能力。成球?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)顯示：CD133+CD44+與CD133-CD44-細(xì)胞成球數(shù)量分別為375±16.82，11±4.58(t=36.16，P<0.01)，提示CD133+CD44+可以作為CRC-CSCs的研究模型。

2.2 LY294002對(duì)CSCs增殖能力的影響

CCK-8數(shù)據(jù)顯示，CSCs增殖能力隨LY294002濃度及作用時(shí)間增加而逐漸削弱，30 μmol/L LY294002組作用3 d后，CSCs增殖抑制率為(53.9±4.12)%，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取30 μmol/L組作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與CCK-8數(shù)據(jù)相吻合，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組體外克隆數(shù)分別為25.67±4.16，390.67±17.01，(t=36.10，P<0.01)，以上數(shù)據(jù)顯示，LY294002對(duì)CSCs的增殖具有明顯的抑制作用。

2.3 LY294002對(duì)CSCs自我更新能力的影響

成球?qū)嶒?yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞球數(shù)量分別為15.67±4.04，370±17.69，(t=33.82，P<0.01)；LDA實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組CSCs比例分別為(12.75±2.04)%，(66.02±2.47)%，(t=28.77，P<0.01)；以上數(shù)據(jù)提示實(shí)驗(yàn)組CSCs自我更新能力受到明顯削弱。

2.4 LY294002對(duì)CSCs細(xì)胞周期的影響

FCM數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組G0G1細(xì)胞比例分別為79.65±2.41，66.22±3.71，(t=5.26，P<0.01)；G2M比例分別為10.52±0.80，11.38±2.11，(t=0.65，P>0.05)；S期比例分別為9.83±1.66，22.46±1.65，(t=9.33，P<0.01)；數(shù)據(jù)顯示，LY294002導(dǎo)致了CSCs G0G1期細(xì)胞周期阻滯，從而影響細(xì)胞的分化及增殖能力。

2.5 LY294002對(duì)CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組誘騙受體3(DcR3)(t=15.38，P<0.01)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)(t=27.61，P<0.01)、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)(t=11.68，P<0.01)及細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(t=11.96，P<0.01)相對(duì)表達(dá)明顯下降。提示LY294002可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控CSCs惡性行為。

2.6 LY294002對(duì)CSCs中PI3K/Akt/mTOR通路基因蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步驗(yàn)證及明確LY294002通過PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控CSCs的具體機(jī)制，通過FCM檢測(cè)該通路基因蛋白質(zhì)表達(dá)及磷酸化Akt(p-Akt)表達(dá)變化。數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)組中DcR3(t=11.53，P<0.01)、Bcl-2(t=13.54，P<0.01)、mTOR(t=10.66，P<0.01)及Cyclin D1(t=9.21，P<0.01)蛋白表達(dá)量明顯下降。Akt磷酸化蛋白表達(dá)下降(t=7.10，P<0.01)，提示LY294002可能通過抑制磷酸化Akt進(jìn)而抑制PI3K/Akt/mTOR通路，削弱CSCs的惡性行為。

3 討論

CSCs是存在于腫瘤中極小群(甚至無法檢測(cè))具有強(qiáng)大自我更新及成瘤能力的細(xì)胞，CSCs具有干細(xì)胞特征，對(duì)傳統(tǒng)放化療不敏感，最終介導(dǎo)了腫瘤的耐藥、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[11]。探索CSCs維持自我更新、增殖能力的內(nèi)在機(jī)制以靶向殺傷CSCs，已經(jīng)成為腫瘤研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)[12]。但CSCs比例極少，獲取足夠的細(xì)胞并保證細(xì)胞模型的正確性就顯得尤為重要。目前獲取CSCs的方法主要包括：無血清懸浮培養(yǎng)法，免疫磁珠分選法(MACS)及流式細(xì)胞術(shù)分選(FACS)法，前兩種方法操作簡單、成本低，但獲得CSCs純度較低。FACS獲得的細(xì)胞純度高可以作為CSCs理想的研究模型，但其技術(shù)難度高、操作復(fù)雜，應(yīng)用并不廣泛[13-14]。本課題組結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，F(xiàn)ACS獲得CD133+CD44+及CD133-CD44-細(xì)胞群，并通過成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)其自我更新能力，證明CD133+CD44+具有CSCs特征，而CD133-CD44-細(xì)胞不具有。Zhou等[6]研究也證明HCT116細(xì)胞中的CD133+CD44+細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我更新、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力，具有CSCs特征。以上數(shù)據(jù)顯示CD133+CD44+細(xì)胞可以作為CRC-CSCs研究理想的細(xì)胞模型，并用于本研究，并進(jìn)一步研究PI3K/Akt/mTOR通路在維持CSCs惡性行為中的作用。

PI3K/Akt/mTOR通路被報(bào)道在包括CRC在內(nèi)的多種腫瘤中異常激活，參與腫瘤血管生成、增殖、抗凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移過程，此通路的激活與腫瘤低分化、高浸潤度及淋巴轉(zhuǎn)移正相關(guān)[15]。PI3K磷酸化PIP2形成PIP3，繼而磷酸化激活下游Akt等促進(jìn)細(xì)胞惡性行為。激活的Akt能夠上調(diào)Cyclin D1、c-myc等促進(jìn)增殖；同時(shí)激活的Akt上調(diào)mTOR促進(jìn)細(xì)胞生長；上調(diào)VEGF促進(jìn)血管生成；另外，激活的Akt通過激活Bcl-2發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)[16]。目前PI3K/Akt/mTOR通路在普通腫瘤細(xì)胞或腫瘤群體細(xì)胞中研究較多，但在決定腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵—CSCs中研究未見報(bào)道。本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)CSCs與非CSCs在基因表達(dá)及功能、生物學(xué)行為方面存在巨大差異，CSCs數(shù)量極少甚至無法檢測(cè)，基因在CSCs中的功能可能會(huì)被大量的非CSCs所掩蓋和干擾，治療策略無法靶向殺滅CSCs，最終導(dǎo)致CSCs存活及由此介導(dǎo)的腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)[7]。所以，研究并靶向作用CSCs維持惡性行為的分子機(jī)制可能是腫瘤治療的關(guān)鍵[12]。因此本課題在前期研究基礎(chǔ)上，在純化的CRC-SCs中研究此通路對(duì)腫瘤惡性行為的影響及機(jī)制。

LY294002是強(qiáng)力的PI3K/Akt/mTOR通路抑制劑，通過非特異性阻斷通路導(dǎo)致Akt磷酸化水平下降，進(jìn)一步抑制下游基因Cyclin D1、mTOR、Bcl-2、DcR3、VEGF等表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加、增殖及侵襲遷移能力下降[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，LY294002作用CSCs后，PI3K/Akt/mTOR通路被抑制，Akt磷酸化水平降低并導(dǎo)致下游靶基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)下降，CSCs的自我更新能力、增殖能力明顯削弱，出現(xiàn)G0G1期周期阻滯。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)檢測(cè)多采用Western-blot技術(shù)，但是其檢測(cè)周期長、所需樣本量較大、對(duì)磷酸化蛋白檢測(cè)準(zhǔn)確性不高，用于檢測(cè)極少量的CSCs中蛋白質(zhì)的表達(dá)非常困難。本研究采用FCM檢測(cè)蛋白質(zhì)，具有操作時(shí)間短、所需樣本少、對(duì)磷酸化蛋白檢測(cè)更加準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，非常有利于檢測(cè)CSCs中磷酸化蛋白的表達(dá)[9-10]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)LY294002可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路削弱CSCs的自我更新能力，這一作用未見其他研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道。自我更新是指CSCs通過對(duì)稱或者不對(duì)稱分裂產(chǎn)生新的CSCs及各種腫瘤細(xì)胞，自我更新能夠維持CSCs多分化潛能，是腫瘤存活、治療抵抗、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的關(guān)鍵，深入研究CSCs自我更新機(jī)制，對(duì)于開發(fā)靶向殺傷CSCs的藥物及治療策略具有重要意義。但本研究提示的LY294002可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路調(diào)控CSCs自我更新能力的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。以上研究提示，LY294002可以阻斷PI3K/Akt/mTOR通路激活進(jìn)而抑制CRC-CSCs自我更新、增殖，表明阻斷該通路可能有效抑制CSCs惡性行為，為靶向殺滅CSCs提供新的靶點(diǎn)。

[1] Chen W,Zheng R,Baade PD,etal.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132.

[2] Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1):7-30.

[3] 吳安琪,曙光,王晶,等.癌癥干細(xì)胞特性及靶向治療進(jìn)展[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志,2017,4(9):1-8.

[4] 高兆亞,王延召,雷福明,等.結(jié)直腸癌基因治療進(jìn)展[J].轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)電子雜志,2017,4(9):55-58.

[5] Zeuner A,Todaro M,Stassi G,etal.Colorectal cancer stem cells:from the crypt to the clinic[J].Cell Stem Cell,2014,15(6):692-705.

[6] Zhou JY,Chen M,Ma L,etal.Role of CD44(high)/CD133(high) HCT-116 cells in the tumorigenesis of colon cancer[J].Oncotarget,2016,7(7):7657-7666.

[7] Leng Z,Tao K,Xia Q,etal.Kruppel-like factor 4 acts as an oncogene in colon cancer stem cell-enriched spheroid cells[J].PLoS One,2013,8(2):e56082.

[8] Reynolds BA,Weiss S.Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell[J].Dev Biol,1996,175(1):1-13.

[9] Grafone T,Palmisano M,Nicci C,etal.Monitoring of FLT3 phosphorylation status and its response to drugs by flow cytometry in AML blast cells[J].Hematol Oncol,2008,26(3):159-166.

[10] Bardet V,Tamburini J,Ifrah N,etal.Single cell analysis of phosphoinositide 3-kinase/Akt and ERK activation in acute myeloid leukemia by flow cytometry[J].Haematologica,2006,91(6):757-764.

[11] De Angelis ML,De Maria R,Baiocchi M.How to Assess Drug Resistance in Cancer Stem Cells[J].Methods Mol Biol,2018,1692:107-115.

[12] Ahmad G, Amiji MM. Cancer stem cell-targeted therapeutics and delivery strategies[J]. Expert Opin Drug Deliv, 2017, 14(8): 997-1008.

[13] Mehta P,Novak C,Raghavan S,etal.Self-Renewal and CSCs In Vitro Enrichment:Growth as Floating Spheres[J].Methods Mol Biol,2018,1692:61-75.

[14] Lawson DA,Bhakta NR,Kessenbrock K,etal.Single-cell analysis reveals a stem-cell program in human metastatic breast cancer cells[J].Nature,2015,526(7571):131-135.

[15] Qian DC,Xiao X,Byun J,etal.PI3K/Akt/mTOR Signaling and Plasma Membrane Proteins Are Implicated in Responsiveness to Adjuvant Dendritic Cell Vaccination for Metastatic Colorectal Cancer[J].Clin Cancer Res,2017,23(2):399-406.

[16] Bahrami A,Khazaei M,Hasanzadeh M,etal.Therapeutic Potential of Targeting PI3K/AKT Pathway in Treatment of Colorectal Cancer:Rational and Progress[J].J Cell Biochem,2017，119(8)：1979.

[17] Wang XJ,Feng CW,Li M.ADAM17 mediates hypoxia-induced drug resistance in hepatocellular carcinoma cells through activation of EGFR/PI3K/Akt pathway[J].Mol Cell Biochem,2013,380(1-2):57-66.