萊茵衣藻APC/C復合物基因家族及CrCDC20表達譜分析

羅秋蘭，王潮崗，胡章立

1) 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東深圳 518060；2) 深圳大學光電工程學院，光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室，廣東深圳 518060；3) 深圳大學龍華生物產業(yè)創(chuàng)新研究院，深圳市海洋藻類生物工程技術研究中心，廣東深圳 518060；4) 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海南海口 570100

微藻是一類直徑在2～200 μm，具有光合作用，分布于各種水體(海水和淡水)的生物[1]. 在能源危機和環(huán)境污染日益加劇的今天，微藻被認為是生產生物柴油的理想來源[2]. 由于生產成本居高不下，微藻生物柴油的發(fā)展受到極大的限制[3].篩選和改良獲得優(yōu)良藻株一度成為研究的熱點. 利用基因工程和代謝工程，人工制造工程藻株是最簡單、最直接的方法，可以快速獲得理想的工程藻株以滿足各種生產需求，但是需要對微藻油脂代謝和基因調控網絡了解清楚.

萊茵衣藻是產油微藻重要的模式生物，基因組序列已知，蛋白質數據庫完備，分子生物學和代謝方法日趨成熟[4-5]. 現代分子表達譜技術和蛋白組學的發(fā)展，也使得深入研究微藻在環(huán)境脅迫下油脂積累的細胞活動成為可能[6]. 萊茵衣藻在缺氮脅迫時，最先響應的是應激反應和碳同化過程酶，隨之油脂生物合成酶的含量增加，用于積累短鏈的游離脂肪酸[7]. 細胞通過代謝調節(jié)適應. 萊茵衣藻油脂代謝途徑已經闡明，許多關鍵酶基因已被克隆. 萊茵衣藻中存在著兩條途徑最終生成三酰甘油(triacylglycerols，TAGs)——生物柴油的主要成分，分別是Kennedy途徑和PDAT途徑. 二酰甘油?；D移酶(diacylgycerol acyltransferase，DGATs)和磷脂二酰甘油?；D移酶(phospholipids: diacylglycerol acyltransferase，PDATs)是重要的油脂合成關鍵限速酶[8-9]. 同時，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC)和甘油三磷酸脫氫酶(glycerol 3-phosphate dehydrogenase，G3PD)等其他碳代謝相關酶在微藻TAGs合成中也發(fā)揮著重要的作用[10-11]. 對這些關鍵酶基因進行調控表達時，人們發(fā)現無法同時提高微藻油脂含量和生物量[12-13].

如何同時提高油脂含量和生物量是微藻生物柴油生產面臨的重要問題.微藻大多為單細胞生物，進行無性繁殖. 微藻的生物量綜合取決于細胞的數目和大小，而細胞周期嚴格地控制著細胞的數量. 細胞周期一般分為親代細胞物質準備和細胞分裂形成兩個子代細胞兩個階段，標準的細胞周期劃分為第1間隔期(G1期)、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)合成期(S期)、第2間隔期(G2期)分裂期(M 期)4 個不同時相[14]. 細胞周期進程受到各級調控因子精確而嚴密的控制，包括細胞周期依賴的蛋白激酶復合物(cyclin-dependent kinase complex，CDK)、CDK的正性調控因子——細胞周期蛋白和CDK的負性調控因子——CDK的抑制劑(cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)[15]. APC/C主要通過泛素化降解細胞周期蛋白CDK、Cyclin和CKI等，來實現對細胞周期的精細調控.APC/C是一種E3泛素連接酶復合體，由至少11個不同的蛋白亞基組成[16]，其活性受兩個激活因子(CDH1和CDC20)調控. 泛素激活酶E1在ATP水解能參與下將泛素Ub激活，激活后的泛素從E1轉移至與APC/C結合的泛素結合酶E2，共同特異性識別靶蛋白，對靶蛋白的賴氨酸殘基進行泛素化修飾，最后形成一個包含異肽鍵的泛素-蛋白結合物，被26S蛋白酶體識別降解.CDC20(又稱Sln1，Fzy，p55CDC)和CDH1(又稱Hct1，Ste9/SRW1，FZR)既是APC/C復合物中重要的輔助因子，又是APC/C復合物特異性識別并集合底物蛋白質的關鍵所在[17]. 文獻[18]研究表明，細胞中CDC20的表達峰值出現在G2期至M期，而CDH1的表達高峰在M期至G1期. 在微藻中這些APC/C復合物各個亞基的情況是怎么樣的，目前尚處于未知狀態(tài).

本研究系統(tǒng)地分析了萊茵衣藻中編碼APC/C復合物的基因家族，并對APC/C復合物的蛋白質特性進行分析，同時，揭示CrCDC20基因在缺氮或缺硫條件下的表達情況，為后期研究微藻細胞周期控制的分子機制奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 藻株及培養(yǎng)條件

萊茵衣藻藻株cc124購自萊茵衣藻資源中心(https://www.chlamycollection.org/).從固體平板上挑取藻株到HSM培養(yǎng)基中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)條件：25 ℃，24 h全光照，光照強度90 μE·m-2·s-1)，培養(yǎng)至對數生長期.

1.2 萊茵衣藻APC/C序列信息獲取

萊茵衣藻基因組V5.5版本及蛋白質序列下載于植物基因組學網站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). 分析目前NCBI(national center for biotechnology information)中已登錄的APC/C蛋白質的氨基酸序列，以保守性區(qū)作為種子序列，運用HMMER3.1b2軟件(http://www.hmmer.org/)對萊茵衣藻蛋白質數據庫進行檢索，去除冗余序列，獲得萊茵衣藻APC/C復合物蛋白質序列. 通過本地Blast程序，獲得萊茵衣藻APC/C編碼基因信息，其基因結構運用GSDS2.0軟件進行分析.

1.3 萊茵衣藻APC/C蛋白質特性分析

運用ExPASy計算平臺(http://www.expasy.org/)對萊茵衣藻APC/C蛋白質的相對分子質量大小(1 u=1 D)、等電點、親疏水性和結構域等特性進行分析.通過BLASTp在NCBI數據庫進行同源性搜索獲得萊茵衣藻APC/C同源蛋白質，序列利用MEGA7.0軟件進行ClustalW比對，采用鄰接法則(Neighbour-Joining，NJ)的P-距離模型構建進化樹，設定自展值為1 000.利用WoLF PSORT軟件(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)對萊茵衣藻APC/C蛋白質進行定位預測.

1.4 缺氮或缺硫脅迫下CrCDC20表達譜分析

取對數生長期的萊茵衣藻細胞，按照體積比為1∶2接種，分別進行正常、缺氮或缺硫培養(yǎng)0、2、4、6和8 d，離心收集藻細胞，液氮速凍，用于總RNA提取，設定3個生物學重復.采用Trizol法提取總RNA，反轉錄成cDNA. 利用Primer Premier 5.0軟件設計CrCDC20定量引物. 使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒(Takara Bio Inc. Otsu, Japan)進行實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, rt-RT-qPCR)，分析缺氮或缺氮脅迫下不同時間內CrCDC20表達量的變化.

2 結果與分析

2.1 萊茵衣藻APC/C基因序列信息的挖掘

本研究以目前NCBI中已登錄的APC/C蛋白質保守性區(qū)為種子序列，通過HMMER3.1b2軟件，對萊茵衣藻蛋白質數據庫進行同源性檢索，去除冗余序列，最終獲得13個萊茵衣藻APC/C復合物氨基酸序列，其中包含了CDC20和CDH1兩個激活因子. 對萊茵衣藻APC/C復合物的編碼基因進行分析發(fā)現，13個APC/C成員的長度差別很大，基因序列從1 099～20 735堿基對(base pair, bp)，編碼蛋白的氨基酸數目在66～4 087不等(表1). 萊茵衣藻APC/C編碼基因在13號染色體上呈基因簇出現，包含了CrAPC1、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC11， 其他的APC/C基因分別位于第1、3、9、10、12、16和17號染色體上(表1).

表1 萊茵衣藻APC/C基因序列信息

(續(xù)表1)

2.2 萊茵衣藻APC/C基因結構

通過GSDS2.0軟件分析了萊茵衣藻APC/C的基因結構(圖1). 由圖1可知，CrCDC20、CrAPC10和CrAPC11無內含子，CrCDC28和CrAPC13分別含有3個和1個內含子，其余的萊茵衣藻APC/C基因都具有超過10個以上的內含子. 此外，萊茵衣藻APC/C基因均含有長度不等的5′-或3′-非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)，說明萊茵衣藻的APC/C基因編碼方式較為復雜.

2.3 萊茵衣藻APC/C蛋白質特性分析

采用Expasy分析萊茵衣藻APC/C蛋白質的相對分子質量大小、等電點和親疏水性，如表2，表2結果顯示，CrAPC/C蛋白質具有極強的親水性，均為親水性蛋白質.CrAPC/C的相對分子質量大小很不一致，范圍在7.37～390.41 kD，等電點范圍在4.34～9.02.

圖1 萊茵衣藻APC/C基因結構組成Fig.1 The structures of APC/C genes in C. reinhardtii

蛋白相對分子質量/kD等電點蛋白相對分子質量/kD等電點蛋白相對分子質量/kD等電點蛋白相對分子質量/kD等電點CrCDC2050．508．54CrAPC2142．075．91CrAPC5103．995．97CrAPC1016．576．18CrCDH145．989．02CrAPC3108．667．70CrAPC690．215．71CrAPC119．926．25CrCDC28103．598．06CrAPC4103．324．78CrAPC885．335．89CrAPC137．374．34CrAPC1390．418．70

對萊茵衣藻APC/C蛋白質的保守結構域進行分析(圖2)，發(fā)現CrCDC20和CrCDH1具有7個WD40重復基序；CrAPC3、CrAPC6和CrAPC8包含多個34肽重復序列基序(tetratricopeptide repeat，TPR)；CrAPC2和CrAPC10含有APC復合物特定的結構域，其中，CrAPC2包含的APC2結構域與cullin結構域十分類似；APC11含有一個RING結構域；這些結構域可能是萊茵衣藻APC/C復合物生物活性的關鍵中心.WoLF PSORT軟件預測所有的萊茵衣藻APC/C蛋白質都定位于細胞核中，參與細胞周期控制.

圖2 萊茵衣藻APC/C蛋白質的結構域Fig.2 Domain of APC/C proteins in C. reinhardtii

2.4 萊茵衣藻APC/C進化樹分析

通過構建系統(tǒng)進化樹分析萊茵衣藻(Chlamydomanosreinhardtii，Cr)APC/C蛋白質和模式生物擬南芥(Arabidopisisthaliana，At)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，Sc)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe972h，Sp)、大豆(Glycinemax，Gm)、人(Homosapiens，Hs)、斑馬魚(Daniorerio，Dr)、秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，Ce)、小鼠(Musmusculus，Mm)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster，Dm:)、盤基網柄(Dictyosteliumdiscoideum，Dd)和杜氏利什曼原蟲(Leishmaniadonovani，Ld)來源的APC/C蛋白質的進化關系. 由圖3可以看出，除了CDH1和CDC20與其他物種具有較高保守性外，萊茵衣藻APC/C蛋白質具有獨特性，CrAPC1、CrAPC3、CrAPC4、CrAPC5、CrAPC6、CrAPC10和CrAPC13聚為一類. CrAPC2與動物來源APC蛋白質親緣關系更近，而CrAPC8和CrCDC28與植物來源APC蛋白質相似度更高.

圖3 萊茵衣藻APC/C蛋白質的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of CrAPC/C proteins

2.5 萊茵衣藻CrCDC20基因表達譜分析

缺氮或缺硫培養(yǎng)是常用的誘導萊茵衣藻積累油脂的脅迫條件. CDC20是真核生物APC/C復合物的核心亞基. 為了闡述CrCDC20在缺氮或缺硫脅迫下的表達規(guī)律，本研究分別提取了缺氮或缺硫0、2、4、6和8 d的總RNA，反轉錄成cDNA，進行了rt-RT-qPCR. 結果顯示，CrCDC20在缺氮培養(yǎng)時呈下調表達，在第8天表達量最低，下調了79.7%；缺硫脅迫誘導CrCDC20上調表達，在缺硫第4天出現了高峰值，上調了4.5倍(圖4). 由圖4可見，缺硫脅迫誘導CrCDC20表達，缺氮時CrCDC20表達受到抑制.

圖4 缺氮或缺硫脅迫時CrCDC20基因表達譜Fig.4 The expression profiles of CrCDC20 under nitrogen or sulfur deficiency condition

3 討 論

本研究系統(tǒng)比較分析了萊茵衣藻APC/C蛋白質以及編碼基因的結構與分子特征，為以后研究細胞周期調控的APC/C目的基因和蛋白質提供了方便. 萊茵衣藻APC/C基因家族共有13個成員，其中，包含兩個激活因子CrCDC20和CrCDH1(表1). APC/C蛋白質復合體是細胞周期控制的重要調控元件，一般由11個以上的APC蛋白質和2個激活因子組成.高等動物中APC2和APC11是APC/C復合體的主要骨架和基本組成，僅有APC2和APC11即可完成APC/C復合體的泛素化降解作用[16]. 動物來源的APC2蛋白質含有cullin結構域而APC11具有一個RING-H2結構域，本研究發(fā)現萊茵衣藻APC2和APC11具有類似的結構域(圖2)，且萊茵衣藻APC2與動物的APC2蛋白質同源性更高(圖3)，可能萊茵衣藻APC/C復合體與動物中的APC/C復合體作用方式相似.

光合微藻可以通過交替的光-暗周期實現同步化培養(yǎng)[19]. 萊茵衣藻在一個光-暗周期內可以通過有絲分裂從一個母細胞產生2～32個子細胞．藻細胞在G1期進行增長，體積增大數倍，再經歷n次有絲分裂期，產生2n子細胞. 細胞分裂的次數取決母細胞的大小，同時受到光照強度、營養(yǎng)供給和溫度的調節(jié)[20]. 藻細胞中油脂的合成同樣受到細胞周期的調控，細胞質和質體膜中的油脂合成發(fā)生在光階段的早期，在之后的細胞周期中維持著一個較穩(wěn)定的水平；TAG的積累模式與膜脂不同，在光階段的2 h內急速合成，在2～8 h內出現一個降解峰，隨后又逐漸合成，直到進入G0期(16 h)，又出現降解，呈現一種明顯的周期變化[21].

缺氮或缺硫脅迫是常見的萊茵衣藻產油誘導條件. 缺氮下萊茵衣藻的油脂含量可以比在完全培養(yǎng)基(Sueoka’s high salt medium，HSM)中提高十幾倍，但是生物量的積累卻不及HSM中的1/10[22]，缺硫脅迫下，萊茵衣藻油脂上升的同時生物量也在下降[23]. 本研究分析了APC/C復合物中的激活因子CrCDC20在缺氮或缺硫條件下的表達量，發(fā)現CrCDC20在缺氮或缺硫條件下基因表達正好相反，缺氮時CrCDC20表達受到抑制，而缺硫能顯著誘導其表達(圖4)，這可能是由于缺氮和缺硫下APC/C復合物對細胞生理活動的調控方式是不一樣的.

真核細胞中APC/C復合物除了調控細胞周期，還具有多種其他的功能，如影響配子發(fā)生、激素信號轉導、與雙鏈RNA結合蛋白4(double stranded RNA binding protein 4，DRB4)結合控制RNA沉默[24-25]. 目前APC/C復合物在微藻中的研究還很少見，APC/C復合物的功能還有待進一步發(fā)現，它們參與細胞生理活動調控的分子機制尚不清楚，需要深入研究. 微藻除了生產生物柴油，由于它們還可以大量積累各種各樣生物活性物質，如葉黃素、蝦青素、胡蘿卜素和藻藍蛋白等，用于食品、化妝品、保健品和藥品等行業(yè)[26]，研究調控細胞周期的APC/C復合物的功能，為提高微藻的生物量積累奠定基礎，具有十分重要的理論和經濟價值.

結 語

本研究通過生物信息學方法，對萊茵衣藻APC/C復合物的蛋白質及其編碼基因進行系統(tǒng)比較分析，共發(fā)現了13個萊茵衣藻APC/C復合物亞基，其中，包括保守的激活因子CDC20和CDH1.發(fā)現萊茵衣藻APC/C基因在13號染色體上成簇出現，部分萊茵衣藻APC/C復合物亞基具有物種特有性.同時發(fā)現CrCDC20基因在缺氮下顯著下調而在缺硫脅迫時上調，為后期研究微藻細胞周期控制的分子機制奠定了理論基礎.

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