重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的治療作用

王 震，樊心童，許春陽，張達(dá)矜，喬媛媛，李金鳳，尹紅蕾，段海峰，王運(yùn)良

多發(fā)性硬化是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性白質(zhì)炎性脫髓鞘病變，具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為可能是一些攜有先天遺傳易感基因的個(gè)體有易發(fā)生免疫調(diào)節(jié)功能紊亂的趨勢，在后天環(huán)境中外因的作用下，誘發(fā)對(duì)中樞髓鞘成分的異常自身免疫應(yīng)答而致病[1]。目前世界上多發(fā)性硬化的急性期治療主要是大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊、靜脈注射免疫球蛋白和血漿置換，緩解期治療主要采用β-干擾素和芬戈莫德等藥物治療，但是上述方法效果并不理想，并且有一定的副作用。

近年來發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)在誘導(dǎo)免疫耐受方面有重要作用[2]，能夠影響非特異性免疫和特異性免疫[3]。因此，本研究采用人粒細(xì)胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)皮下注射實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠經(jīng)典模型[4]，旨在觀察rhG-CSF在多發(fā)性硬化疾病過程中的免疫調(diào)節(jié)作用，為多發(fā)性硬化臨床方案的優(yōu)化提供新的思路。

1 資料和方法

1.1 一般資料 無特定病原體級(jí)6～8周健康雌性C57BL/6小鼠[SCXK號(hào)-(京)2014-0006] 購買于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物房內(nèi)。百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)、弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)、兔抗多克隆抗體膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)均購自美國Sigma公司；MOG35-55(純度>95%)購自北京中科亞光生物科技有限公司；rhG-CSF購買于齊魯制藥有限公司；熒光單克隆抗體抗PE-NK-1.1、APC-CD3、FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3購自美國Biolegend公司；流式細(xì)胞儀購自美國Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE小鼠模型構(gòu)建及分組 參照文獻(xiàn)[5-7] 建立EAE小鼠模型。40只小鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為2組：一組10只作為正常對(duì)照組不作處理，另一組30只制備EAE模型。在造模的過程中小鼠死亡6只，根據(jù)神經(jīng)功能評(píng)分將剩余的24只小鼠隨機(jī)分為治療組(12只)和模型組(12只)。從免疫后第15天開始，治療組皮下注射rhG-CSF 200 μg/d，連續(xù)注射14 d。EAE組和對(duì)照組小鼠給予相同體積的生理鹽水作為對(duì)照。

1.2.2 EAE小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 第0～28天用雙盲法對(duì)所有小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分(一共持續(xù)評(píng)分28 d)：不發(fā)病記為0分，尾巴張力降低或輕度步態(tài)笨拙記為1分，后肢力量輕度減弱記為2分，后肢力量明顯減弱記為3分，后肢癱瘓記為4分，后肢癱瘓合并前肢力量減弱或?yàn)l死狀態(tài)記為5分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可參考文獻(xiàn)[8] 。

1.2.3 病理學(xué)觀察 第29天將所有小鼠處死，從每組中隨機(jī)抽取5只小鼠進(jìn)行脊髓組織學(xué)觀察。打開腹腔解剖出脾臟，在磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)中浸泡，解剖出腦和脊髓做成石蠟切片，用蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色和勞克堅(jiān)勞藍(lán)(luxol fast blue,LFB)染色觀察脊髓炎性細(xì)胞浸潤和脊髓脫髓鞘的改變。

1.2.4 EAE小鼠脾臟Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞的檢測第29天，取上述5只小鼠的脾臟研磨后制成單細(xì)胞懸液，每份細(xì)胞懸液約含1107個(gè)細(xì)胞，用PE-NK-1.1、APC-CD3抗體避光室溫孵育30 min，用PBS洗2次，然后用500 μg PBS重懸上機(jī)檢測；然后去上述細(xì)胞懸液，用FITC-CD4、APC-CD25抗體避光4 ℃孵育30 min，固化液固化，再用透化buffer洗滌，加入Fc阻斷劑避光4 ℃孵育15 min，最后加入PE-Foxp3避光4℃孵育30 min，然后洗滌重懸上機(jī)檢測。通過流式細(xì)胞儀檢測，并用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)。CD3陰性，NK-1.1陽性的象限即為自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的比例，CD4、CD25、Foxp3陽性的象限即為調(diào)節(jié)性T(regulatory T，Treg)細(xì)胞的比例。

1.2.5 Western blot 檢測EAE小鼠脊髓GFAP和MBP的表達(dá) 冰上分離小鼠脊髓，將組織置于裂解液中，反復(fù)凍融離心提取組織總蛋白；蛋白定量采用BCA-200蛋白定量試劑盒；每個(gè)樣品取20 μg，與上樣緩沖液和二硫蘇糖醇以8∶10∶2比例混勻，煮沸變性5 min，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜；將膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h，用兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白和髓鞘堿性蛋白抗體4 ℃雜交過夜；充分洗去未結(jié)合抗體，加入抗兔的辣根過氧化物酶標(biāo)記繼續(xù)室溫孵育1 h，用增強(qiáng)型化學(xué)熒光素顯色。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 10.0軟件。2組間比較用t檢驗(yàn)，3組間比較采用F檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過圖像-Pro Plus5.0快速圖像分析儀對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行分析，用Photoshop分析A圖的灰度值，除去內(nèi)參對(duì)目的條帶的影響，以對(duì)照組的灰度值作為單位1，對(duì)目的條帶進(jìn)行比較得出相對(duì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分 各組小鼠的神經(jīng)評(píng)分見圖1。對(duì)照組神經(jīng)功能正常，評(píng)分為0；從第12天開始，EAE造模小鼠開始出現(xiàn)發(fā)病的跡象，主要表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)遲緩和后肢癱瘓，尾巴下垂且拖地。第13天，治療組和對(duì)照組神經(jīng)功能評(píng)分開始出現(xiàn)顯著差異(t=2.375，P<0.05)；第21天，治療組和模型組神經(jīng)功能評(píng)分出現(xiàn)顯著差異(t=2.032，P<0.05)。第24天治療組發(fā)病達(dá)到高峰期，但臨床癥狀較模型組明顯減輕；模型組第25天發(fā)病達(dá)到最高峰表現(xiàn)為蹣跚步態(tài)，后肢完全癱瘓，嚴(yán)重的前肢也表現(xiàn)無力。

圖1 各組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分

2.2 小鼠的脊髓組織學(xué)變化 對(duì)照組小鼠脊髓組織學(xué)表現(xiàn)正常，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘的改變，脊髓炎性細(xì)胞浸潤評(píng)分和脫髓鞘評(píng)分均為0。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠的脊髓炎性浸潤細(xì)胞明顯著，經(jīng)rhG-CSF治療后炎性浸潤細(xì)胞顯著減少(如箭頭所示)評(píng)分為2.80±0.45。LFB染色顯示對(duì)照組小鼠脊髓髓鞘排列緊密，且著色深，評(píng)分為3.0±0.70，模型組小鼠脊髓脫髓鞘情況嚴(yán)重，治療組髓鞘脫失情況顯著改善。與模型組相比，治療組小鼠炎性細(xì)胞浸潤顯著改善，評(píng)分為2.80±0.45(t=3.796，P=0.005),脫髓鞘程度也顯著改善(t=3.201，P=0.013)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，評(píng)分為1.80±0.44。見圖2。

2.3 小鼠脾臟Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞比例的比較 3組小鼠之間Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞比例的比較(見圖3)。治療組NK細(xì)胞的比例明顯低于模型組(t=4.325，P=0.003)。治療組與對(duì)照組相比，NK細(xì)胞比例明顯升高(t=2.032，P=0.049)。3組間進(jìn)行方差分析F=15.741，P=0.0004。治療組Treg細(xì)胞明顯比模型組升高(t=3.463，P<0.05)。治療組Treg細(xì)胞比例高于對(duì)照組(t=2.358，P=0.046)，3組間進(jìn)行方差分析，F(xiàn)=10.879，P=0.002(表1)。

1：HE染色；2：LFB染色圖2 小鼠脊髓組織學(xué)觀察(HE，×100；LFB，×10)

圖3 通過流式細(xì)胞儀測定NK1.1CD3-和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的水平

組 別nTreg細(xì)胞NK細(xì)胞對(duì)照組53．83±0．213．80±0．52模型組51．45±0．92?6．10±0．44?治療組54．62±0．32?#4．32±0．63?#

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.4 小鼠脊髓GFAP和MBP表達(dá) Western blot結(jié)果見圖4A，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明治療組小鼠脊髓組織中GFAP的表達(dá)量明顯低于模型組(t=2.436，P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(t=3.224,P<0.05)。而治療組小鼠脊髓組織中MBP的表達(dá)明顯高于模型組(t=3.213,P<0.05)，但是仍然低于對(duì)照組(t=2.662,P<0.05)。

*與對(duì)照組相比P<0.05，#與模型組相比，P<0.05圖4 小鼠脊髓GFAP和MBP的表達(dá)

3 討論

G-CSF在1986年第一次被記錄并且被克隆，人類的G-CSF基因被定為17號(hào)染色體，由骨間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞因炎癥刺激而產(chǎn)生。近年來，越來越多的研究表明G-CSF除了能動(dòng)員造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞等細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著重要作用[2]。

在本研究中，我們成功誘導(dǎo)EAE模型，給予rhG-CSF治療后，各組經(jīng)過28 d的神經(jīng)功能評(píng)分，發(fā)現(xiàn)治療組在經(jīng)rhG-CSF治療1周后神經(jīng)功能評(píng)分顯著低于模型組；GFAP主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，與炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度有密切關(guān)聯(lián)，治療組經(jīng)rhG-CSF治療后GFAP的表達(dá)量顯著低于模型組；MBP是一種主要在神經(jīng)纖維髓鞘的蛋白質(zhì)表達(dá)，它在維持神經(jīng)纖維髓鞘的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定上有著至關(guān)重要的作用，具有神經(jīng)組織特異性，治療組MBP的表達(dá)量顯著高于模型組；HE染色和LFB染色顯示治療組的脊髓的炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘評(píng)分顯著降低。這些結(jié)果都表明rhG-CSF在治療EAE小鼠模型中有較好的效果。且用流式細(xì)胞儀檢測小鼠脾臟的Treg細(xì)胞的比例，發(fā)現(xiàn)治療組小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞比例顯著上升。

Treg細(xì)胞是近幾年來發(fā)現(xiàn)的表達(dá)CD4、CD25以及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的T細(xì)胞亞型[9]。Treg細(xì)胞可以通過上調(diào)其表面的白介素(interleukin，IL)-2受體，從而抑制IL-2與效應(yīng)性T細(xì)胞的結(jié)合[10]。Treg細(xì)胞可以通過凋亡靶細(xì)胞來發(fā)揮免疫抑制作用，同時(shí)也能通過削弱共刺激信號(hào)以及抗原提成的作用從而對(duì)抗原提成細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)[11]。淋巴細(xì)胞活化基因-3(lymphocyte ac-tivation gene-3,LAG-3)在Treg細(xì)胞膜上高表達(dá)，LAG-3能與APC的MHCⅡ結(jié)合，從而可以抑制樹突狀細(xì)胞的活化[12]。Treg細(xì)胞在維持體內(nèi)免疫應(yīng)答穩(wěn)態(tài)過程中起重要作用。Zou等[13]發(fā)現(xiàn)G-CSF可以降低CXC趨化性細(xì)胞因子受體-4的配體基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，從而有利于動(dòng)員骨髓里的Treg細(xì)胞到外周血中，從而抑制自身免疫反應(yīng)。Haller等[14]用G-CSF聯(lián)合低劑量的抗胸腺細(xì)胞球蛋白治療I型糖尿病，發(fā)現(xiàn)這種聯(lián)合治療能夠上調(diào)外周血Treg細(xì)胞，并且能夠維護(hù)胰腺β細(xì)胞的功能。上述研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果相一致。因此，我們認(rèn)為以rhG-CSF治療EAE小鼠的機(jī)制與其促進(jìn)外周血Treg細(xì)胞增加有密切關(guān)系，因而抑制炎癥反應(yīng)，緩解了EAE相關(guān)的各種癥狀。

有些研究還發(fā)現(xiàn)，低劑量IL-2可以顯著增加Treg細(xì)胞的比例[15]。這些結(jié)果提示我們?cè)诤罄m(xù)的研究中可以探索G-CSF聯(lián)合低劑量IL-2與單用G-CSF相比是否能夠更加顯著的改善治療效果。

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