三氧可通過減輕小鼠腦小膠質(zhì)細胞激活預(yù)防抑郁癥發(fā)生

蘆國芳，安建雄，馬 鈞，錢曉焱，王 永，楊小榮

抑郁癥是危害人類健康和情感性行為的主要疾病之一。據(jù)Mathers和Loncar[1]預(yù)計，到2030年抑郁癥在全球疾病致殘率和經(jīng)濟負擔的排名中將位居第二。Phillips等[2]2009年在英國TheLancet雜志上發(fā)表文章，稱中國抑郁癥的患病率為6.1%，按其比率推算，國內(nèi)抑郁癥患者已達到9 000萬。由于抑郁癥發(fā)病機制尚不清楚,至今尚缺乏防治抑郁癥的理想方法。然而，已有大量研究表明大腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)炎癥在抑郁癥中扮有重要角色，此外，大量研究證實三氧可有效抑制機體炎癥反應(yīng)[3]，已有研究表明小膠質(zhì)細胞激活引起的炎癥反應(yīng)是抑郁癥發(fā)生與發(fā)展的重要原因[4-6]。然而迄今尚無三氧防治抑郁癥的報道。本研究通過建立抑郁癥小鼠模型，檢測各組小鼠小膠質(zhì)細胞數(shù)量與炎癥因子白介素(interleukin,IL)-1β，IL-6和腫瘤壞死因子(tumer necrosis factor- α,TNF-α)的表達水平，探究三氧對抑郁癥小鼠的防治作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6J小鼠40只，清潔級，雄性，體重20～30 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證編號：SCXK(京)2016-0011；醫(yī)用三氧水由三氧氣體溶于500 mL的醫(yī)用滅菌水配制而成的，溶液為80 μg/mL由醫(yī)用三氧治療儀(德國，Ozomed Basic)完成；特制的50 mL離心管；曠場實驗系統(tǒng)(美國，Panlab，Harvard Apparatus)；免疫組化IBA1一抗(日本W(wǎng)ako公司)；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒(康為世紀生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型制備 將40只小鼠隨機分為4組，即模型組、模型加三氧組、對照組和對照加三氧組(預(yù)防性干預(yù)及治療性干預(yù)小鼠數(shù)量和分組方法一致)，對模型組和模型加三氧組小鼠進行連續(xù)7 d每天1 h的束縛應(yīng)激(為保證模型成功，每天束縛小鼠時間需一致)制備抑郁癥小鼠模型[7]。

1.2.1.1 三氧預(yù)防性干預(yù) 造模前3 d對模型加三氧組和對照加三氧組進行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干預(yù)，模型組和對照組腹腔注射0.9%生理鹽水設(shè)為對照，1/2d，共5次。

1.2.1.2 三氧治療性干預(yù) 造模成功后，對模型加三氧組和對照加三氧組進行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干預(yù)，模型組和對照組腹腔注射0.9%生理鹽水設(shè)為對照，1/2d，共5次。

1.2.2 行為學測試 自三氧干預(yù)結(jié)束起進行懸尾實驗(tail suspension test,TST)、強迫游泳實驗(forced swimming test,FST)、新環(huán)境抑制進食實驗(novelty suppressed feeding test，NSFT)和開放曠場實驗(open field test,OFT)行為學測試,實驗順序隨機，為期5 d。

1.2.2.1 TST 實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，以緩解動物緊張情緒。實驗時將小鼠尾巴用膠帶固定起來懸掛在實驗架(高于地面50 cm)上，實驗持續(xù)6 min，前2 min統(tǒng)計小鼠不動前的潛伏期時間，后4 min統(tǒng)計小鼠不動總時間，全程通過高清數(shù)碼攝像機記錄實驗過程[8]。

1.2.2.2 FST 實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，以緩解動物緊張情緒。實驗時將小鼠置于直徑15 cm，水深10 cm,水溫(20±2)℃的上方開口圓柱形玻璃容器中，實驗持續(xù)6 min，前2 min統(tǒng)計小鼠不動前的潛伏期時間，后4 min統(tǒng)計小鼠不動的總時間，全程通過高清數(shù)碼攝像機記錄實驗過程[9]。

1.2.2.3 NSFT 實驗前1 d將實驗小鼠換至新鼠籠，24 h后進行測試。實驗前60 min，將小鼠移至安靜的測試房，實驗時將小鼠置于40 cm× 40 cm×40 cm的上方開口的玻璃盒中，在玻璃盒的中央放置一白色器皿，其上放一顆鼠糧，從把小鼠放入玻璃盒中開始計時至小鼠開始進食為止，實驗持續(xù)5 min,若5 min內(nèi)小鼠無進食，則記為5 min，全程通過高清數(shù)碼攝像機記錄實驗過程[10]。

1.2.2.4 OFT 實驗前60 min,將小鼠移至安靜的測試房并打開軟件記錄日期，小鼠標號后進行測試，實驗時將小鼠置于曠場實驗裝置60 cm×60 cm×60cm中心區(qū)域，通過曠場設(shè)備上方的攝像機及其相連的監(jiān)視器觀察5 min內(nèi)小鼠的活動情況，包括休息時間、運動距離與速度，進入中心區(qū)域的次數(shù)和時間，實驗結(jié)束后將小鼠放回籠內(nèi)，用75%乙醇徹底擦拭實驗裝置，并用紙巾擦干[11]。

1.2.3 取材 實驗結(jié)束后，用配制好的10%的水合氯醛(10 μL/g)進行腹腔注射，待小鼠麻醉成功后剖開胸腔，從左心室插管，用加入肝素的生理鹽水進行心室灌注，灌注速度為8 mL/min。待肝臟顏色由粉紅變透亮后取出全腦或立即分離海馬、額葉和杏仁核組織，全腦組織立即固定于4%多聚甲醛溶液中進行免疫組化染色(immunohistochemistry,IHC)，分離的各個腦區(qū)的組織液氮凍存用于RT-PCR檢測。

1.2.4 IHC染色 4%多聚甲醛固定的小鼠大腦經(jīng)過30%蔗糖脫水3 d，冰凍切片40 μm腦片浸泡于磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)中，換成含3% H2O2PBS孵育10 min。用PBS洗一遍，加入封閉液(30 mg/mL 5%封閉液)，20%山羊血清(1xPBS)搖床孵育1 h。吸去封閉液，加入稀釋的IBA1一抗，搖床孵育過夜。用PBS洗3遍，加入相應(yīng)的二抗(辣根過氧化物酶標記)，搖床孵育2 h。用PBS洗3遍，加入二氧基聯(lián)苯胺顯色液顯色5 min，然后將腦片在PBS中貼到陽離子包被的載玻片上，晾干后經(jīng)乙醇梯度脫水二甲苯透明后用中性樹脂封片。

1.2.5 RT-PCR檢測 RT-PCR檢測額葉、海馬及杏仁核中IL-1β、IL-6和TNF-α含量水平。

1.2.5.1 RNA抽提 取液氮冷凍右側(cè)海馬組織勻漿Trizol試劑盒(Promega)抽提總RNA。

1.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取1 μg總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transgen)說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.5.3 實時定量PCR cDNA用UltraSYRB supermix with ROX1(康為世紀生物技術(shù)有限公司)進行PCR擴增，定量反應(yīng)在Agilent Technologies Mx3005P定量PCR儀上進行。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共進行40次循環(huán)。PCR引物由primer bank以及在線Primer 3.0軟件設(shè)計，訂購于Life Technologies公司。引物序列分別為：IL-1β，上游引物GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，下游引物ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；IL-6,上游引物TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，下游引物TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；TNF-α，上游引物CCCTCACACTCAGATCATCTTCT，下游引物GCTACGACGTGGGCTACAG。

2 結(jié)果

2.1 三氧預(yù)防性干預(yù) 預(yù)防性干預(yù)時間如圖1A。

2.1.1 行為學結(jié)果 在TST、FST、NSFT及OFT中，對照組與對照加三氧組各項行為學測試差異無統(tǒng)計學意義(F=4.056，P>0.05)。

2.1.1.1 TST 模型組不動之前的潛伏期時間較對照組短(F=2.303,P<0.05)，模型組潛伏期時間較模型加三氧組短(F=3.478,P<0.05)(圖1F),后4 min總的不動時間各組差異無統(tǒng)計學意義(F=3.807,P>0.05)(圖1E)。

2.1.1.2 FST 模型組不動之前的潛伏時間較對照組短(F=3.144,P<0.05),模型組潛伏期時間較模型加三氧組短(F=3.112,P<0.05)(圖1C)。模型組后4 min總不動的時間較對照組長(F=4.356,P<0.05)，模型組后4 min不動的總時間較模型加三氧組長(F=3.798，P<0.05)(圖1B)。

2.1.1.3 NSFT 模型組潛伏期時間較對照組長(F=3.499,P<0.05)，模型組較模型加三氧組潛伏期時間長(F=2.809,P<0.05)(圖1D)。

2.1.1.4 OFT 我們監(jiān)測了小鼠行動軌跡圖(圖G)，運動距離與速度，休息時間，進入中心區(qū)域的次數(shù)與速度。從總區(qū)域運動距離與速度看，模型組運動距離較對照組短(F=4.528,P<0.05)，模型組運動距離較模型加三氧組短(F=2.478，P<0.05)。模型組運動速度較對照組慢(F=6.089,P<0.05)，模型組運動速度較模型加三氧組慢(F=3.125，P<0.05)(圖1H、1I)。從在中心區(qū)的休息時間看，模型組休息時間較對照組長(F=3.950,P<0.05)，模型組休息時間較模型加三氧組長(F=4.908,P<0.05)(圖1J)。就進入中心區(qū)域的速度來看，模型組較對照組運行速度慢(F=2.256,P<0.05)，模型組休息時間較模型加三氧組短(F=3.675,P<0.05)(圖1K)。從進入中心區(qū)域的次數(shù)可以看出各組比較差異無統(tǒng)計學意義(F=4.997,P>0.05)(圖1L)。

2.1.2 光鏡觀察各組小鼠同一部位海馬、額葉和杏仁核的小膠質(zhì)細胞形態(tài)(圖2A)及數(shù)量變化 在海馬、額葉及杏仁核中，對照組與對照加三氧組小膠質(zhì)細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(F=3.456，P>0.05)。模型組額葉區(qū)小膠質(zhì)細胞數(shù)量較對照組多(F=4.361,P<0.05)，模型組額葉區(qū)小膠質(zhì)細胞數(shù)量較模型加三氧組多(F=3.112，P<0.05)。模型組海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞數(shù)量較對照組多(F=3.456,P<0.05)，模型組海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞數(shù)量較模型加三氧組多(F=4.005，P<0.05)。各組小鼠杏仁核區(qū)小膠質(zhì)細胞形態(tài)及數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(F=6.012,P>0.05)(圖2B)。

2.1.3 RT-PCR檢測小鼠腦中額葉、海馬和杏仁核組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 對照組與對照加三氧組炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(F=4.675，P>0.05)。額葉組織中，模型組炎癥因子TNF-α的水平高于對照組(F=2.265,P<0.05)，模型組TNF-α的水平高于模型加三氧組(F=4.556，P<0.05)，而2組IL-6、IL-1β的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2C)。海馬組織中，模型組炎癥因子TNF-α、IL-1β的水平高于對照組(F=8.038,P<0.05)，模型組TNF-α、IL-1β的水平高于模型加三氧組(F=6.007，P<0.05)，而2組IL-6的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(圖2D)(F=5.808,P>0.05)。杏仁核組織中，各組IL-6、IL-1β和TNF-α的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(F=3.124,P>0.05)(圖2E)。

圖1 三氧預(yù)防性干預(yù)行為學

圖2 三氧預(yù)防性干預(yù)海馬、額葉、杏仁核區(qū)域小膠質(zhì)細胞形態(tài)及數(shù)量

2.2 三氧治療性干預(yù) 治療性干預(yù)時間如圖3A。

2.2.1 行為學結(jié)果 在TST、FST、NSFT及OFT中，對照組與對照加三氧組各項行為學測試結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2.1.1 TST 模型組總的不動時間長于對照組(F=3.765，P<0.05)，模型組與模型加三氧組總的不動時間相比差異無統(tǒng)計學意義(F=5.234,P>0.05)(圖3E)。模型組潛伏期時間與對照組及模型加三氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(F=6.096，P>0.05)(F=4.675，P>0.05)(圖3F)。

2.2.1.2 FST 模型組總的不動時間較對照組短(F=4.567,P<0.05)，模型組與模型加三氧組總的不動時間相比差異無統(tǒng)計學意義(F=2.788，P>0.05)(圖3B)。模型組潛伏期時間較模型加三氧組長(F=5.787，P<0.05)，模型組潛伏期時間與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(F=4.665，P>0.05)(圖3C)。

2.2.1.3 NSFT 模型組潛伏期時間較對照組長(F=3.004，P<0.05)，模型組潛伏期時間與模型加三氧組相比差異無統(tǒng)計學意義(F=3.487,P>0.05)(圖3D)。

2.2.1.4 OFT 我們監(jiān)測了小鼠行動軌跡圖(圖3G)，運動距離與速度，休息時間，進入中心區(qū)域的次數(shù)與速度。從運動距離看，模型組與模型加三氧組及對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(F=4.825，P>0.05)(圖3H)。從休息時間看，模型組休息時間較模型加三氧組短(F=2.404,P<0.05)(圖3I)。就進入中心區(qū)域的速度來看模型加三氧組與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(F=0.347,P>0.05)(圖3K)。從進入中心區(qū)域的次數(shù)可以看出，模型組進入中心區(qū)域次數(shù)少于對照組(F=3.665，P<0.05)，而模型組與模型加三氧組進入中心區(qū)域次數(shù)相比差異無統(tǒng)計學意義(圖3L)(F=1.761,P>0.05)。

圖3 三氧治療性干預(yù)行為學

2.2.2 光鏡觀察各組小鼠同一部位額葉、海馬和杏仁核的小膠質(zhì)細胞形態(tài)(圖4A)及數(shù)量變化 在額葉、海馬和杏仁核區(qū)域，對照組與對照加三氧組小膠質(zhì)細胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(F=6.453，P>0.05)。在額葉、海馬和杏仁核區(qū)域，模型組小膠質(zhì)細胞數(shù)量均多于對照組(F=4.534，P<0.05)，模型組與模型加三氧組小膠質(zhì)細胞數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(F=3.564，P>0.05)(圖4B)。

2.2.3 RT-PCR檢測小鼠腦中額葉、海馬和杏仁核組織中炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 對照組與對照加三氧組炎癥因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平相比差異無統(tǒng)計學意義(F=4.895，P>0.05)。額葉組織中，模型組炎癥因子IL-1β、TNF-α的水平高于對照組(F=5.674,P<0.05)(F=3.022，P<0.05)，而模型組與模型加三氧組IL-1β、TNF-α的水平相比差異無統(tǒng)計學意義(F=1.452,P>0.05)，各組炎癥因子IL-6的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(F=4.052，P>0.05)(圖4C)。海馬組織中模型組IL-6的水平高于模型加三氧組(F=3.354，P<0.05)，模型組IL-6的水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(F=5.889，P>0.05)，模型組TNF-α的水平高于對照組(F=2.677，P<0.05),模型組與模型加三氧組TNF-α和IL-1β的水平相比差異無統(tǒng)計學意義(F=3.454，P>0.05)(圖4D)。杏仁核組織中模型組TNF-α的水平均低于對照組與模型加三氧組(F=3.948，P<0.05)，模型組IL-6的水平高于對照組(F=3.044，P<0.05)，模型組與模型加三氧組IL-6的水平相比差異無統(tǒng)計學意義(F=4.056，P>0.05)，各組炎癥因子IL-1β的水平比較差異無統(tǒng)計學意義(F=2.526,P>0.05)(圖4E)。

圖4 三氧治療性干預(yù)海馬、額葉、杏仁核區(qū)域小膠質(zhì)細胞形態(tài)及數(shù)量

3 討論

抑郁癥又稱抑郁障礙，是常見的精神疾病之一，主要表現(xiàn)為情緒低落，興趣減低，悲觀，思維遲緩，缺乏主動性，自責自罪，飲食、睡眠差，擔心自己患有各種疾病，感到全身多處不適，嚴重者可出現(xiàn)自殺傾向和行為。目前治療抑郁癥的主要方法是抗抑郁藥，但常見的抗抑郁藥作用機制單一，且有頭暈、口干，心率加快等副作用，而產(chǎn)生耐藥反應(yīng)及自殺傾向嚴重者則需采用電休克治療，電休克可有效治療重度抑郁癥，但存在一定的局限性[12]。本研究探索三氧對抑郁癥的預(yù)防及治療作用。

抑郁癥確切發(fā)病機制尚不清楚，大腦中小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)炎癥扮有重要角色。小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)常駐免疫細胞，是機體抵御損傷和感染的第一道也是最主要的防線。在正常生理情況下，它主要起到免疫監(jiān)視、免疫防御和組織修復(fù)作用[13]，適度激活小膠質(zhì)細胞對神經(jīng)元有保護作用，但過度激活則釋放大量炎性介質(zhì)和神經(jīng)毒性物質(zhì)。有研究證實，源自小膠質(zhì)細胞的促炎因子如IL-1β、TNF-α等會調(diào)制下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(hypothalamus-pituitary-adrenocorticalaxis,HPA)軸的活動，阻礙皮質(zhì)激素對HPA軸的負反饋，造成HPA軸活動過度[4]，損傷情緒中樞神經(jīng)可塑性[5]，降低腦中單胺類遞質(zhì)如5-羥色胺等的含量[6]，從而引起抑郁癥發(fā)生與發(fā)展。

三氧有抗炎、抗感染、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。有研究證實,大鼠腹腔注射三氧可減輕血液TNF-α炎癥因子表達，增強超氧化物歧化酶Orgotein活性,降低活性氧水平，達到抗炎，抗氧化作用[3]。三氧可減少糖尿病腎病模型大鼠腎病組織凋亡表達，降低腎臟組織中TNF-α、缺氧誘導(dǎo)因子-1α水平[14]，抑制糖尿病視網(wǎng)膜病模型大鼠血清炎性因子釋放[15]。因此我們推測三氧可能通過抑制腦小膠質(zhì)細胞激活引起的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而達到防治抑郁癥的目的。迄今尚未有關(guān)三氧防治抑郁癥的報道。

本研究采用束縛應(yīng)激法成功建立抑郁癥小鼠模型，同時采用三氧干預(yù)，行為學測試發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性三氧干預(yù)可有效減少小鼠抑郁行為，但治療性三氧干預(yù)卻未能減輕小鼠抑郁表型。進一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性三氧干預(yù)可減少小鼠腦內(nèi)海馬、額葉和杏仁核區(qū)域小膠質(zhì)細胞數(shù)量，降低IL-6、IL-1β與TNF-α等炎癥因子水平。然而，治療性三氧干預(yù)卻未能抑制小膠質(zhì)細胞的激活與炎癥因子表達。

本研究發(fā)現(xiàn)三氧對小鼠抑郁癥發(fā)生有一定預(yù)防作用，但無治療效果，可能與下列因素有關(guān)：①三氧可有效抑制抑郁癥早期神經(jīng)炎癥，但對小膠質(zhì)細胞被充分激活后形成的神經(jīng)炎癥效果較差；②三氧的濃度和量可能與抑郁癥防治效果相關(guān)。本研究中三氧濃度及劑量為單一的80 μg/mL，0.1 mL/10 g，結(jié)果顯示對小鼠抑郁發(fā)生有一定預(yù)防效果，但無治療作用。未來多種濃度和劑量進行干預(yù)將有利于發(fā)現(xiàn)三氧對抑郁作用的治療窗口；③治療效果可能也與給藥途徑有關(guān)。例如三氧大自血療法已廣泛應(yīng)用于臨床，三氧與血液結(jié)合后可激活免疫活性細胞，使干擾素、白介素等細胞因子的釋放增加，進而增強機體免疫及抗炎能力。本研究結(jié)論僅基于三氧水腹腔注射，大自血療法抗抑郁作用有待進一步研究。

綜上所述，一定濃度和劑量三氧水腹腔注射對預(yù)防小鼠抑郁癥發(fā)生有一定作用，其機制可能與減少小鼠腦內(nèi)海馬、額葉和杏仁核區(qū)域的小膠質(zhì)細胞數(shù)量，降低小鼠腦中海馬、額葉及杏仁核區(qū)域炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達水平有關(guān)。但本研究未發(fā)現(xiàn)三氧水腹腔注射對已經(jīng)形成的抑郁小鼠模型有治療效果。

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