長鏈非編碼RNA在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究現(xiàn)狀及前景

劉頌平 華克勤

1江蘇大學附屬第四醫(yī)院婦科（江蘇鎮(zhèn)江212001）；2復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科（上海200090）

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是婦產(chǎn)科的常見病和多發(fā)病之一，該病病理性質(zhì)雖然是一種良性病變，但其生物學特性上卻具有增生、浸潤、遠處轉(zhuǎn)移、反復復發(fā)等一系列惡性行為，嚴重影響廣大女性身心健康［1］。EMs具體發(fā)病機制迄今不明，存在多種學說。近年來，隨著干細胞研究的飛速進展，EMs的干細胞發(fā)病學說日益受到重視［2］。長鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度超過200 nt但不能編碼相關蛋白的RNA，在RNA水平上（表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等）發(fā)揮基因表達調(diào)控作用［3］，是近年來的研究熱點，其在干細胞及EMs基礎研究領域已經(jīng)得了一定進展，因此在EMs的干細胞發(fā)病學說方面具有廣闊的研究前景。本文結(jié)合lncRNA在婦科惡性腫瘤及干細胞領域中的相關研究進展，將其在EMs中的研究現(xiàn)狀及前景作一綜述。

1 長鏈非編碼RNA概述

在非編碼RNAs超家族中，lncRNAs是比例最高的一類［4］，其缺乏開放閱讀框，且序列具有保守性，最初被認為是基因轉(zhuǎn)錄的“暗物質(zhì)”，不具有生物學功能。隨著基因組高通量測序技術如深度測序和微陣列芯片等的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)其具有非常重要的生物學功能。

lncRNA種類繁多，目前尚無十分有效的分類方法。根據(jù)lncRNA在基因組中與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因的位置關系，可分為反義lncRNA、基因內(nèi)lncRNA、異質(zhì)性lncRNA、基因間lncRNA和增強子式lncRNA。lncRNA主要存在于細胞核內(nèi)，但在細胞質(zhì)、細胞器內(nèi)亦有一定分布，其具有較強的組織特異性，不僅不同組織間的表達量不同，甚至同一組織不同部位，不同發(fā)育階段的表達都具有較大差異［5］。

目前，lncRNA的研究主要集中于lncRNA數(shù)據(jù)挖掘和功能驗證兩個方面，前者主要通過高通量測序技術的ln?cRNA?seq、lncRNA芯片檢測技術、基于去除核糖體RNA（rRNA）的建庫方法等，而lncRNA?seq主要包括lncRNA細胞水平驗證與動物活體水平驗證，其中在細胞水平上，常用的研究方法包括以下幾種：（1）采用qRT?PCR定量檢測lncRNA或?qū)ncRNA?seq 測序數(shù)據(jù)進行驗證［6］；（2）采取原位雜交技術、FISH技術對lncRNA進行定位分析［7］；（3）通過構(gòu)建lncRNA載體，對lncRNA進行獲得性或功能缺失方面的研究，或者利用反義寡核苷酸鏈（ASO）、siRNA等抑制細胞內(nèi)目標lncRNA 的表達［8］；（4）通過RNA pull down、RNA?IP、CHIRP?seq等方法來確定能與目標lncRNA相互作用的蛋白質(zhì)、RNA 和 DNA［9?10］。

lncRNA的功能復雜，目前研究最多的是其作為競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）發(fā)揮生物學調(diào)控作用這一方面。早在2011年就有學者提出了“ceRNA假說”［6］，認為細胞內(nèi)存在ceRNA，這些ceRNA分子（mRNA，lncRNA、假基因等）能夠通過miRNA應答元件競爭結(jié)合相同的miRNA以調(diào)節(jié)彼此表達水平。lncRNA作為一類重要的ceRNA，其通常通過與miRNA互補配對形成復合體，從而導致細胞內(nèi)參與下游基因調(diào)控的miRNA的數(shù)量降低。例如，在心肌梗死和細胞自噬的發(fā)生發(fā)展過程中，lncRNA?APF通過與miR?188?3p結(jié)合，導致了下游靶標ATG7的表達量出現(xiàn)下降［7］。lncRNA的其他功能還包括：調(diào)節(jié)組蛋白修飾與染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)其他基因的表達、影響其他RNA生成、作為小RNA分子的前體等，其通過各種途徑在生物學調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。

2 長鏈非編碼RNA與婦科惡性腫瘤

研究顯示，lncRNA通過參與腫瘤細胞凋亡調(diào)控、腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移過程，以及通過表觀遺傳調(diào)控的方式影響腫瘤細胞的生長等在惡性腫瘤的發(fā)生和進展中發(fā)揮重要作用［8］。

宮頸癌是我國最常見的婦科惡性腫瘤，通過非編碼RNA組科學數(shù)據(jù)庫（NONCODE）篩選與宮頸組織相關的lncRNA，結(jié)果顯示與宮頸癌發(fā)病有關的lncRNA主要包 括 H19、HOTAIR、ANRIL、SRA、MALAT1、BCYRNl與UCA1。H19長度約2.3 kb，位于小鼠7號染色體末端和人類同源區(qū)域染色體的11p15.5區(qū)，可作為致癌或抑癌基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后方面發(fā)揮作用。研究顯示［9］，H19在宮頸癌細胞系中高表達，過表達和敲減實驗證實H19促進細胞增殖和腫瘤細胞克隆形成，但是并不影響細胞凋亡和遷移。有學者對TCGA數(shù)據(jù)庫和12個獨立研究結(jié)果進行多元回歸分析顯示［10］，H19高表達是宮頸癌獨立的不良預后因素。HOTAIR在宮頸癌組織表達上調(diào)，而miR?17?5p表達下調(diào)，兩者呈負相關，敲除HOTAIR抑制宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲，熒光素酶報告基因顯示miR?17?5p直接與HOTAIR的3′?UTR結(jié)合，miR?17?5p 敲除可以使沉默HOTAIR后導致的腫瘤細胞抑制得以恢復，因此可以認為HOTAIR作為miR?17?5p的分子海綿發(fā)揮促進腫瘤生長的作用［11］。此外，文獻顯示，lncRNA ANRIL可以通過PI3K/Akt途徑促進宮頸癌腫瘤細胞生成，其高表達提示預后不良［12］，MALAT1的表達與宮頸上皮組織HPV感染呈正相關，其通過誘導上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?tomesen?chymal Transition，EMT）促進宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，可以作為宮頸癌預防和治療的靶點［13］。

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)達國家最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在美國每年約有39 080例新發(fā)病例，7 400例死亡病例。XU等［14］通過GO分類法和KEGG數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌與正常子宮內(nèi)膜間存在172個差異lncRNAs，但其具體與子宮內(nèi)膜癌發(fā)病之間關系的研究相對較少。研究顯示［15］，H19通過抑制 let?7，一種轉(zhuǎn)錄后抑制致癌基因的腫瘤抑制因子，促進子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的遷徙和侵襲，二甲雙胍可以通過DNA甲基化下調(diào)H19抑制腫瘤細胞生長，這一途徑有望成為子宮內(nèi)膜癌新的治療靶點。另一研究顯示［16］，H19在子宮內(nèi)膜癌組織的表達明顯高于癌旁組織，敲除H19顯著抑制內(nèi)膜癌HEC?1?B細胞系的遷徙和侵襲能力，H19表達下調(diào)能夠使Snail水平下降，E?cadherin水平升高，從而使EMT得以部分恢復，因此認為H19可以通過調(diào)節(jié)EMT過程促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展。WANG等［17］發(fā)現(xiàn)，lncRNA BANCR在子宮內(nèi)膜癌中表達增加，且與患者FIGO分期、病理類型、有無肌層浸潤、淋巴轉(zhuǎn)移有關，體外實驗中，敲除BANCR后，腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制，MMP2和MMP1表達減少，ERK/MAPK信號通路受到抑制，認為BANCR通過調(diào)節(jié)MMP2/MMP1表達，激活ERK/MAPK信號通路促進內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，有望成為其預后指標和治療靶點。另有學者發(fā)現(xiàn)［18］，GAS5在子宮內(nèi)膜癌中具有腫瘤抑制作用，其能夠通過提高抑癌基因PTEN的表達促進腫瘤細胞凋亡，從而在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病中的發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

卵巢癌缺乏有效的早期篩查手段，診斷時大部分患者已達晚期，5年生存率不超過45%［19］，居婦科惡性腫瘤病死率首位。近年來研究顯示［20］，lncRNA在卵巢癌不同發(fā)展階段顯示出不同生物學功能，其表達水平與早期診斷、預后及對化療的敏感性有關。微陣列分析顯示［21］，卵巢癌組織與正常卵巢組織間差異表達的lncRNA上調(diào)者672個，下調(diào)者549個。WU等［22］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ABHD11?AS1在卵巢癌中表達升高，與腫瘤分期及分化程度有關，其通過直接與RhoC結(jié)合，使其下游分子P70s6k、MMP2和BCL?xL的表達增加，促進卵巢癌A2780及OVCAR3細胞系的增殖、侵襲和遷移，在裸鼠動物體內(nèi)實驗中亦顯示出類似的影響。JIN等［23］研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1在卵巢癌組織及細胞系中均表達上調(diào)，與患者5年生存率呈負相關，其通過PI3K/AKT信號通路促進EMT參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展?；熌退幨怯绊懧殉舶╊A后的重要因素，部分lncRNA與化療藥物的耐藥密切相關。研究顯示［24］，HOTAIR通過wnt/β?catenin信號通路促進卵巢癌細胞增殖，即細胞周期進展，敲除后細胞增殖受到抑制，細胞停留于G1期，原代細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)HOTAIR的表達增加與卵巢癌化療耐藥有關，體外及體內(nèi)實驗均顯示，HOTAIR通過wnt/β?catenin信號通路促進卵巢癌細胞對順鉑耐藥，該過程在使用wnt/β?catenin抑制劑后得以逆轉(zhuǎn)，因此認為HOTAIR可以作為卵巢癌潛在的治療靶點。

3 長鏈非編碼RNA與子宮內(nèi)膜異位癥

3.1 lncRNA在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中的研究進展EMs迄今為止病因不明，存在多種學說，但均不能充分闡述其具體發(fā)病機制。近年來，隨著測序技術的不斷進步，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)，其功能相繼得到驗證，在EMs的基礎研究中亦取得了重要進展，為探討EMs的發(fā)病機制提供了新的思路。2014年有研究者報道［25］，EMs異位內(nèi)膜較在位內(nèi)膜存在948個差異lncRNA及4 088個差異mRNA，其中差異lncRNAs主要通過蛋白編碼基因的順式和（或）反式調(diào)節(jié)參與EMs的生物學行為。2015年另一研究顯示［26］，取EMs患者在位內(nèi)膜與正常子宮內(nèi)膜（均為晚分泌期）進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)兩者間存在1 277個差異lncRNAs（488上調(diào)，789個下調(diào)），功能分析提示與細胞周期及免疫調(diào)節(jié)有關，進一步采用qRT?PCR進行部分驗證，證實CDK6和AC002454.1與EMs發(fā)病有關。

文獻報道［27?29］，lncRNA中的單核苷酸多態(tài)性與EMs的易感性密切相關，在EMs的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，相關結(jié)果在不同地域人群中亦得到驗證。EMs與lncRNA之間關系的研究目前主要集中于幾個常見的lncRNA，如ANRIL、H19等。研究顯示［30］，ANRIL由染色體9p21區(qū)編碼，該區(qū)域與多種疾病發(fā)生有關，已經(jīng)證實ANRIL與心血管疾病、糖尿病、幾種常見的惡性腫瘤及EMs發(fā)病有關，其通過調(diào)節(jié)鄰近的腫瘤抑制基因CDKN2A/B進而調(diào)節(jié)細胞的增殖和凋亡參與疾病的發(fā)生發(fā)展。ANRIL又名CDKN2B?AS1，LEE等［31］通過比較673例EMs患者及500例對照組發(fā)現(xiàn)，CDKN2B?AS基因中Rs10965235及WNT4基因附近的rs16826658的單核苷酸多態(tài)性在韓國人群中與EMs的發(fā)病有關。而有關ANRIL在EMs中的具體作用機制，NAKA?OKA等［32］認為其主要通過等位基因失衡等一系列因素結(jié)合的染色質(zhì)相互作用介導的基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來實現(xiàn)的。有關H19與EMs的關系，研究顯示［33］，H19在EMs患者在位內(nèi)膜中的表達明顯降低，而let?7水平升高，進而抑制Igf1r轉(zhuǎn)錄后水平的表達，可以導致子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞增殖能力下降，研究者推測H19/Let?7/IGF1R調(diào)節(jié)通路可能損傷EMs患者妊娠內(nèi)膜的準備和容受性，在此基礎上首次報道了基于lncRNA的EMs不孕機制，為探索新的治療方法提供了理論基礎。此外，最新研究證實［34］，通過采用含有l(wèi)ncRNA LINC00261的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EMs細胞系 CRL?7566，可以誘導細胞凋亡，從而導致細胞增殖受到抑制，細胞遷徙能力亦出現(xiàn)減退。

EMs是一種雌激素依賴性疾?。?5］。LIN等［36］發(fā)現(xiàn)，雌激素與其核受體ER?α、ER?β在EMs中具有重要功能，類固醇受體RNA激動子1（SRA1）產(chǎn)生SRA LncRNA和SRA蛋白質(zhì)（SRAP），其可以在雌激素依賴性疾病中通過選擇性剪切事件在RNA和蛋白水平調(diào)節(jié)ER表達，SRA lncRNA和 ER?α在EMs中低表達，而SRAP和ER?β呈高表達，SRA1小干擾RNA治療能夠明顯增加異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞ER?α的表達，卻降低ER?β的表達，同時使細胞增殖減少及凋亡增加，提示在EMs中通過SRA調(diào)節(jié)ER可能在異位內(nèi)膜間質(zhì)細胞的生長中發(fā)揮重要作用。同時，有學者［37］采用免疫組化法檢測了組織中SRAP和ER?β的表達，發(fā)現(xiàn)在從EMs到不典型EMs、EMs惡變透明細胞癌組織中，SRAP的表達逐漸升高，而ER?β的表達逐漸降低，兩者呈負相關，認為SRA與EMs的惡變有關。

3.2 lncRNA在子宮內(nèi)膜異位癥干細胞發(fā)病學說中的研究前景 我們知道，人體組織細胞均由干細胞分化而來，因此可以認為子宮內(nèi)膜細胞以及EMs病灶細胞自然也是由相應的干細胞分化而來。21世紀初就有學者提出了EMs干細胞發(fā)病學說的設想，隨著研究的不斷深入，EMs的干細胞起源學說日益受到認可。干細胞因子是一種多功能細胞因子，能夠刺激多種組織細胞的生長發(fā)育和增殖，而EMs患者腹腔液中的干細胞因子水平較正常婦女明顯升高；同時，單克隆性是干細胞的重要特征之一，而EMs雖為多中心起源，但其每一局部病灶細胞卻呈現(xiàn)明顯的單克隆性，以上現(xiàn)象均支持EMs病灶可能來源于干細胞。由此有學者提出，EMs患者病灶中存在具有干細胞特性或可塑性的未分化的或者未完全分化的細胞，這些不同分化程度的細胞對EMs的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮了重要作用。

子宮內(nèi)膜是一種周期性更新的組織，具有高度增殖活性。早在1978年，PRIANISHNIKOV已經(jīng)推測可能存在子宮內(nèi)膜干細胞。2004年有學者通過克隆形成能力的鑒定于子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細胞中證實了子宮內(nèi)膜干細胞的存在，并于2006年進一步采用標記剩余技術（label Retaining cells，LRC）使內(nèi)膜干細胞得到成功分離和鑒定。TAYLOR等則首次報道子宮外的干細胞亦同樣能夠分化生成子宮內(nèi)膜組織，其檢測了骨髓移植后女性患者的子宮內(nèi)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在來源于骨髓內(nèi)膜細胞，認為骨髓間充質(zhì)干細胞能夠分化形成內(nèi)膜組織，在此基礎上提出干細胞的異位分化同樣可以導致EMs，成為EMs干細胞病因?qū)W的重要內(nèi)容?？偟膩碚f，目前EMs干細胞發(fā)病機制的研究有許多未知的、值得探討的問題仍在研究當中，尤其lncRNA在EMs干細胞發(fā)病機制的研究尚處于起步階段，具有廣闊的研究前景。

迄今為止，研究者已經(jīng)通過各種方法從EMs中分離出間充質(zhì)干細胞并認為其參與該病發(fā)生發(fā)展中的重要環(huán)節(jié)，有望成為新的治療靶點，但其具體機制及途徑不明［38?39］。目前有關lncRNA在EMs間充質(zhì)干細胞中的研究較為少見，但已有較多文獻證實lncRNA通過各種途徑影響間充質(zhì)干細胞的分化過程及參與細胞干性的保持。ZHANG等發(fā)現(xiàn)［40］，lncRNA DANCR對于滑膜起源的間充質(zhì)干細胞（synovium?derived mesenchymal stem cells，SMSC）的成軟骨功能十分重要，其具體機制為DANCR的過度表達使miR?1305下調(diào)，而后者通過改變TGF?β信號通路成員Smad4影響細胞增殖和SMSC細胞的成軟骨功能。同樣，lncRNA在間充質(zhì)干細胞的成骨分化中同樣發(fā)揮重要作用。LIAO等發(fā)現(xiàn)［41］，lncRNA H19在成骨因子BMP9誘導間充質(zhì)干細胞分化早期明顯上調(diào)其水平，隨后迅速下降并逐漸恢復基礎水平，這一過程與BMP9誘導的成骨細胞標記物的表達有關，有趣的是，不論體外或體內(nèi)實驗中，H19在間充質(zhì)干細胞表達或沉默均明顯損傷BMP9誘導的成骨分化過程，且能夠被Notch信號通路的激活所解救，表現(xiàn)為與這一信號通路中配體或受體相結(jié)合的一組miRNA表達的增加，因此認為lncRNA H19作為成骨因子BMP9的重要調(diào)節(jié)子，可以通過調(diào)節(jié)Notch信號通路靶向結(jié)合的miRNAs實現(xiàn)其對間充質(zhì)干細胞成骨分化的調(diào)節(jié)功能，其異常表達可能損傷正常成骨過程，導致骨腫瘤的發(fā)生。此外，體外實驗證實［42］，lncRNA?Bvht可以通過升高心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子及EMT相關基因的表達促進間充質(zhì)干細胞向心肌細胞的分化，而lncRNA ?MEG3通過調(diào)節(jié)miR?140?5p參與人脂肪源性間充質(zhì)干細胞向成脂和成骨分化過程的平衡［43］。鑒于lncRNA在其他組織間充質(zhì)干細胞方面的研究成果，進一步探索其在EMs間充質(zhì)干細胞干性維持、多能分化等方面的具體作用機制及途徑，將在一定程度上促進EMs干細胞發(fā)病學說的發(fā)展。

總的來說，lncRNA可以通過不同的調(diào)控機制參與EMs的發(fā)生、發(fā)展，可能成為診斷和評價預后的一個有效生物學標志物及基因治療的新靶點。然而，目前有關lncRNA與EMs的研究目前并不多見，尚不深入，尤其有關lncRNA在EMs干細胞發(fā)病機制中的研究尚處于起步階段，期待未來科學工作者可以在此領域進行更多更深的探討，必將為EMs的診治提供新的思路。