HPLC同時(shí)測(cè)定寬葉羌活藥材中5種成分含量

唐國(guó)琳 ，黃鳳，高天元，吳情梅，喻文，邱慧，蔣桂華

寬葉羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.為傘形科羌活屬多年生草本植物，俗稱黑藥，藥用部位主要為其干燥根莖及根[1]，主要分布在四川西北部、青海、甘肅、西藏東部等高原地區(qū)[2]。在臨床上常用于治療風(fēng)寒感冒、頭痛、風(fēng)濕痹痛等癥[3-4]?，F(xiàn)代研究表明寬葉羌活藥材具有抗炎、鎮(zhèn)痛解熱、抗心律失常、抗心肌缺血和抗菌等作用[4]。揮發(fā)油、香豆素類、有機(jī)酸類化合物是寬葉羌活中最主要的三大類活性成分[5]。研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸具有抗炎、抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等作用[6-9]；羌活醇和異歐前胡素具有鎮(zhèn)痛、舒張血管[10]、抗病毒活性[11]作用；紫花前胡苷有鎮(zhèn)痛[12]、抗炎[13]、改善學(xué)習(xí)記憶[14]等作用；佛手柑內(nèi)酯有抗衰老、抗腫瘤等作用[15-17]。

關(guān)于寬葉羌活藥材的成分含量測(cè)定已有許多報(bào)道，但只是測(cè)定其中的2或3種成分[18-20]，如高建邦等人同時(shí)測(cè)定了異歐前胡素和阿魏酸的含量。目前中國(guó)藥典2015年版一部主要以羌活醇和異歐前胡素的含量之和控制寬葉羌活藥材的質(zhì)量。眾所周知中藥的多效性源于其復(fù)雜的化學(xué)成分，僅靠一兩個(gè)成分的含量測(cè)定不能反映其他成分的情況，難以真正控制其質(zhì)量。選擇上述5 種成分作為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制研究，更能合理、全面評(píng)價(jià)寬葉羌活藥材質(zhì)量。因此本實(shí)驗(yàn)擬建立同時(shí)測(cè)定上述5種成分的高效液相色譜法，并對(duì)不同批次寬葉羌活藥材進(jìn)行含量測(cè)定，為更進(jìn)一步全面評(píng)價(jià)寬葉羌活藥材質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）、KQ5200E型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）、SQP型電子分析天平（萬分之一賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 試藥

有機(jī)溶劑包括甲醇（分析純）、冰醋酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；色譜乙腈（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；純凈水。對(duì)照品阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、紫花前胡苷、羌活醇、異歐前胡素均購自于成都曼斯特生物科技有限公司，各對(duì)照品純度都達(dá)99%及其以上。

樣品分別來自四川白玉縣、小金縣；青海祁連縣、班瑪縣；甘肅宕昌縣；共計(jì)13批。經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)蔣桂華教授鑒定均為傘形科植物寬葉羌活Notopterygium franchetiiH. de Boiss.的干燥根及根莖。

表1 不同批次寬葉羌活藥材樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

GL Sciences Wondasil C18色譜柱（4.6mm×250 mm，5μm）；乙腈（B）-0.3%醋酸水（A）為流動(dòng)相；流速1 mL﹒min-1；梯度洗脫（0～14min，15%～35%B；14～20min，35%B；20～35min，35%～60%B；35～40min，60%～75%B；40～42min，75%～15%B；42～50min，15%B）；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為315 nm；進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品及樣品的高效液相色譜圖見圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取對(duì)照品紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素各適量，精密稱定，以甲醇溶解，搖勻并定容，制成含紫花前胡苷（239.00μg﹒mL-1、阿魏酸 （174.00μg﹒mL-1）、佛手柑內(nèi)酯（237.00μg﹒mL-1）、羌活醇 （270.00μg﹒mL-1） 和異歐前胡素（217.00μg﹒mL-1） 的混合對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備

參考《中國(guó)藥典》2015年版并結(jié)合文獻(xiàn)[20、22]，選擇以下提取條件：取寬葉羌活粉末（過三號(hào)篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定其質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

圖 1 對(duì)照品（A）及寬葉羌活藥材樣品（B）HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液4，8，12，16，20 μL按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定峰面積。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以對(duì)照品進(jìn)樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 5個(gè)成分的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一寬葉羌活藥材（3號(hào)）樣品約0.3 g，精密稱定，用2.3項(xiàng)下的制樣方法制備樣品，在同一色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積均為10μL，記錄5個(gè)成分的色譜峰面積。結(jié)果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別是1.87%，0.71%，0.53%， 1.89%，1.87%。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一寬葉羌活藥材（3號(hào)）樣品約0.3 g，精密稱定，用2.3項(xiàng)下方法制備1份樣品，在同一色譜條件下，分別在0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣，分別計(jì)算5種成分峰面積的RSD。結(jié)果紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素峰面積RSD分別是0.84%，1.59%，1.11%， 1.77%，1.24%。表明供試品溶液24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取6份同一寬葉羌活藥材（3號(hào)）樣品，各約0.3 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制樣，并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素6次測(cè)定值的RSD分別為2.57%，2.56%，1.83%， 2.98%，1.17%。表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一寬葉羌活藥材（3號(hào)）樣品0.1 g，精密稱定，取混合對(duì)照溶液2 ml，用甲醇定容至25 ml，得紫花前胡苷、阿魏酸、佛手柑內(nèi)酯、羌活醇、異歐前胡素濃度分別為19.20 mg﹒L-1、13.98 mg﹒L-1、19.00 mg﹒L-1、21.6 mg﹒L-1、17.4 mg﹒L-1的新混合對(duì)照品溶液，分別取0.5、1.0、2.0 ml作為加標(biāo)溶液，每個(gè)濃度平行3次。按2.3項(xiàng)下的方法制樣，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見下表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)（n=3）

0.0192 1.6407 97.39 0.0384 1.6608 101.04阿魏酸 0.587 0.0070 0.5938 97.14 98.08 0.97 0.0140 0.6008 98.57 0.0280 0.6147 98.93佛手柑內(nèi)酯 2.099 0.0095 2.1081 95.80 97.37 1.62 0.0190 2.1178 98.95 0.0380 2.1360 97.37羌活醇 1.889 0.0108 1.8997 99.07 100.54 1.39 0.0216 1.9110 101.85 0.0432 1.9352 100.69異歐前胡素 1.495 0.0087 1.5040 103.45 102.59 0.74 0.0174 1.5128 102.3 0.0348 1.5305 102.01

2.9 樣品測(cè)定

取不同批次的寬葉羌活樣品各0.3 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下方法制備供試液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀，每批平行測(cè)定2次，記錄峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出含量。結(jié)果見表4。

表4 不同批次寬葉羌活樣品中主要成分的比較（n=2）（mg﹒g-1）

從表4可以看出：不同產(chǎn)地的寬葉羌活藥材，各成分的含量變化范圍較大。整體來說，寬葉羌活栽培品的異歐前胡素含量較之野生品高，野生品的羌活醇、紫花前胡苷含量較之栽培品高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。關(guān)于栽培品與野生品中羌活醇與異歐前胡素的具體關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

不同產(chǎn)地各成分含量差異很大，可能與采收時(shí)間有關(guān)。青海的羌活與其它產(chǎn)地產(chǎn)的紫花前胡苷含量差異巨大，其原因值得進(jìn)一步探討。

3 討論

3.1 提取溶劑和提取方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇（25 ml、50 ml）、乙醇、甲醇水（80%）、乙醇水（75%）四種溶劑。提取方法比較了超聲提取和加熱回流以及不同提取時(shí)間（30 min、45 min、60 min）。水提取使樣品中香豆素類峰面積降低，且明顯低于醇提樣品所得峰面積；甲醇提取時(shí)總色譜峰面積大于乙醇提取得到的總峰面積；超聲提取易操作。故最終提取溶劑和方法為：加甲醇25 ml超聲30 min。

3.2 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

采用二極管陣列檢測(cè)器，對(duì)5個(gè)被測(cè)成分進(jìn)行190～400 nm 全波長(zhǎng)掃描，圖譜結(jié)果顯示在315 nm處均有較大吸收，出峰數(shù)量多，故選315 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 色譜條件優(yōu)化

對(duì)常用流動(dòng)相（甲醇-水、乙腈-水、 甲醇-0.3%醋酸水、乙腈-0.3%醋酸水）及流動(dòng)相梯度分別進(jìn)行了考察，結(jié)果表明乙腈-0.3%醋酸水、梯度洗脫效果好。并在此基礎(chǔ)上考察了柱溫（25 ℃、30 ℃）和體積流量（0.8、1 ml/min）對(duì)分離效果的影響，柱溫25 ℃，體積流量0. 8 mL/min時(shí)分離效果好。