付珂，周游，王張

黑木耳（Auricularia auricula（L.ex hook.）Underw）使用歷史悠久，營養(yǎng)價值極高，具有保健功能[1]。性平、味甘，能潤肺清腸，具有益氣強(qiáng)身、活血、止血等功效，也是中醫(yī)治療寒濕性腰痛的輔藥[2]。其中西藏黑木耳又稱莫若那布，目前收載于《中華藏本草》，子實體治肺虛咳嗽，脾虛泄瀉[3]。主要含有黑色素、多糖、多酚和黃酮等多種活性成分[4]，營養(yǎng)價值和藥用價極高，在西藏林芝等地區(qū)使用甚廣，從育種到栽培再到多樣性分析都有深入的研究[5-7]。

目前未見西藏黑木耳急性毒性的公開報道，故根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》（2005年）[8]開展相關(guān)研究，為后續(xù)開展量效關(guān)系、有效性、作用機(jī)制和血清藥化、藥代動力學(xué)等研究提供安全劑量范圍參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物

西藏黑木耳采自四川省甘孜藏族自治州理塘縣下木拉鄉(xiāng)上馬巖村，經(jīng)王張副研究員鑒定為Auricularia auricula（L.ex hook.） Underw；生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號 L216090608）。

1.2 動物

昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，48只，體重20±2 g，由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030，《實驗動物質(zhì)量合格證》號：№ 51203500002809。實驗前動物于室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng) 3 d，室內(nèi)溫度（25±1）℃，自由飲水，喂食輻射滅菌維持飼料，實驗動物使用許可證號SYXK（川）2014-124。

1.3 試劑

血常規(guī)測試用試劑：溶血劑（批號1708014）、稀釋劑（批號1707022）和清洗劑（批號1708018）均來自江西特康科技有限公司。血液生化指標(biāo)測試用試劑盒均來自上海特康科技有限公司，見表1。

表1 血液生化指標(biāo)測試用試劑盒情況

1.4 儀器

全自動三分群血液分析儀（型號TEK-Ⅱ MINI，江西特康科技有限公司生產(chǎn)）；全自動生化分析儀（型號TC6010L，江西特康科技有限公司生產(chǎn)）；電子稱（BS-600L，上海有聲衡器有限公司，量程為600 g，精確度為0.1 mg）。

1.5 實驗方法

1.5.1 藥液的配制 取西藏黑木耳，打粉，過80目藥典篩，再轉(zhuǎn)移至小燒杯中，加入生理鹽水配制成濃稠混懸液， 并以灌胃針測試至吸取較難但不至于無法吸取的濃稠度為西藏黑木耳的最大濃度藥液（0.3035 g﹒mL-1）。

1.5.2 預(yù)實驗 取SD 小鼠20只，雌雄各半，給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥西藏黑木耳濃稠混懸液1 次（給藥體積為小鼠能夠接受的最大容積40 mL﹒kg-1，濃度為0.3035 g﹒mL-1），連續(xù)觀察2 d。結(jié)果小鼠狀況良好，無動物死亡，無法計算西藏黑木耳的LD50，故正式實驗以最大給藥量法[9～11]進(jìn)行西藏黑木耳的急性毒性實驗。

1.5.3 正式試驗 取SD小鼠40只，雌雄各半，按體重分層后再隨機(jī)分為空白對照組和西藏黑木耳組，每組20只，雌雄各10只，給藥前禁食不禁水12 h?？瞻讓φ战M灌胃生理鹽水， 西藏黑木耳組灌胃西藏黑木耳的最大濃度藥液（0.3035g﹒mL-1），給藥體積均為40 mL﹒kg-1[12]，僅給藥1次。連續(xù)觀察14 d，觀察記錄小鼠的外觀、分泌物、行為活動、自主活動、中毒癥狀及死亡情況等[13]，同時在給藥前1 d、給藥當(dāng)天、給藥后第7 d和第14 d時， 觀察和記錄各組動物的體重變化及進(jìn)食情況。第14 d處死小鼠前，觀察未死亡動物的一般情況、天然孔道情況后，將動物眼球取血，每組其中10只，雌雄各半，取0.7～0.9 mL抗凝處理；每組另外10只，雌雄各半，取0.7～0.9 mL凝固后分離血清0.2～0.4 mL，立即送檢，測試血常規(guī)和血生化指標(biāo)[14]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況和尸檢結(jié)果

30 min內(nèi)兩組小鼠普遍出現(xiàn)精神萎靡、行動遲緩，但均迅速恢復(fù)正常，飲食飲水正常，觀察期內(nèi)無動物死亡。此后連續(xù)14 d觀察中均未見不良反應(yīng)，其被毛、膚色、鼻、眼、口腔分泌物均未見異常；心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、運(yùn)動功能、反射及痛覺未見異常，未見任何中毒癥狀，無動物死亡。第14 d解剖所有小鼠，內(nèi)部臟器肉眼未見異常。

2.2 體重及飼料消耗量變化情況

西藏黑木耳經(jīng)口一次性灌胃給予雌雄小鼠后14d內(nèi)，雌雄小鼠的體重?zé)o明顯變化；空白對照組和西藏黑木耳組小鼠的飼料消耗量均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，表明西藏黑木耳對飼料消耗量的自然變化沒有影響。見表2～3。

表2 一次性灌胃給予西藏黑木耳后14 d 內(nèi)小鼠體重的變化情況（g，±s）

表2 一次性灌胃給予西藏黑木耳后14 d 內(nèi)小鼠體重的變化情況（g，±s）

注：與給藥前1天比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組 別 性別 只數(shù)（只） 劑量（g﹒kg-1） 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 雄 10 —— 25.31±0.98 25.70±1.05 29.92±2.85## 32.00±1.04##雌10 —— 24.01±1.26 24.89±1.69 28.03±4.36# 27.42±1.83##西藏黑木耳組 雄 10 12.14 26.10±1.59 27.23±1.59 30.96±2.42## 33.02±1.79##雌10 12.14 24.14±1.60 24.54±1.75 25.89±1.57## 27.47±1.71##

表3 一次性灌胃給予西藏黑木耳后14 d 內(nèi)小鼠飼料消耗量的情況[g﹒（kg﹒d）-1，±s]

表3 一次性灌胃給予西藏黑木耳后14 d 內(nèi)小鼠飼料消耗量的情況[g﹒（kg﹒d）-1，±s]

注：與給藥前1天比較，# P＜0.05，## P＜0.01；與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組 別 性別 只數(shù)（只） 劑量（g﹒kg-1） 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對照組 雄 10 —— 40.77±5.97 41.61±4.05 24.69±3.21 32.95±9.50雌10 —— 48.43±7.18 13.90±3.25# 29.50±7.67 32.50±6.07西藏黑木耳組 雄 10 12.14 36.83±6.59 49.20±3.40 32.41±7.53 27.19±0.09雌10 12.14 41.05±0.13 41.66±0.23** 28.01±19.49 24.92±0.82#

2.3 血常規(guī)

西藏黑木耳經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14 d，雄性小鼠的紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積、血小板數(shù)、血小板比積、和血小板分布寬度明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），雄性小鼠的平均血紅蛋白含量十分明顯降低（P＜0.01）；其余各項血液學(xué)指標(biāo)均無明顯變化；此外，雌性小鼠的血液學(xué)指標(biāo)亦無明顯變化。見表4和5。

2.4 血液生化指標(biāo)

西藏黑木耳經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14 d，雄性小鼠的甘油三酯含量十分明顯降低（P＜0.01）；其余各項血液生化學(xué)指標(biāo)均無明顯變化；此外，雌性小鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)亦無明顯變化。見表6。

2.5 組織病理學(xué)

肺臟、心臟、脾臟和腎臟均未見明顯病理變化；肝臟、胃組織和腦組織可見輕度病變；腦組織神經(jīng)細(xì)胞體積縮小、排列疏松：空白對照組（雄性和雌性亞組）、西藏黑木耳組（雄性亞組）的亞組均可見2～3例，由于該病變亦見空白對照組的動物，故推測與西藏黑木耳無關(guān)；胃粘膜腺體增生、炎癥浸潤，胃粘膜壞死，局部壞死脫落：空白對照組（雄性和雌性亞組）、西藏黑木耳組（雌性亞組）各有1例，推測與灌胃操作有關(guān)，而與西藏黑木耳無關(guān)；肝臟普遍都可見空泡變性和少量炎細(xì)胞浸潤：推測可能和受試動物環(huán)境、飲食等因素有關(guān)，而與西藏黑木耳無關(guān)?？傊?，本次實驗中未見由藥物引起的明顯的病理變化。

表4 一次性灌胃給予西藏黑木耳后大鼠的血常規(guī)測定結(jié)果Ⅰ（±s）

表4 一次性灌胃給予西藏黑木耳后大鼠的血常規(guī)測定結(jié)果Ⅰ（±s）

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組別 性別只數(shù)（只）紅細(xì)胞數(shù)（10E12﹒L-1）血紅蛋白含量（g﹒L-1）紅細(xì)胞比積（L﹒L-1）平均紅細(xì)胞體積（Fl）平均血紅蛋白含量（Pg）平均血紅蛋白濃度（g﹒L-1）紅細(xì)胞寬度變異系數(shù)（%）紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差（fL）血小板數(shù)（10E9﹒L-1）空白對照組 雄 5 5.91±0.58 240.00±14.61 0.27±0.03 46.88±1.77 38.58±1.58 866.60±48.27 16.30±0.71 65.28±2037 988.80±195.53雌 5 5.88±0.28 241.80±7.69 0.26±0.01 45.64±0.99 38.96±1.00 898.60±27.37 16.30±0.38 68.76±10.80 1109.20±166.01西藏黑木耳組 雄 5 7.02±0.34** 248.01±5.43 0.32±0.01*44.58±2.29 35.01±2.01**798.76±43.98 15.67±0.40 58.04±28.49 1638.60±205.14**雌 5 5.82±0.89 231.21±30.49 0.25±0.05 45.12±1.31 37.89±2.39 889.60±57.01 16.41±0.39 68.57±21.02 1310.60±431.45

表5 一次性灌胃給予西藏黑木耳后大鼠的血常規(guī)測定結(jié)果Ⅱ（±s）

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組別 性別只數(shù)（只）平均血小板體積（fL）血小板分布寬度（%）白細(xì)胞數(shù)（10E9﹒L-1）淋巴細(xì)胞絕對值（10E9﹒L-1）中間細(xì)胞絕對值（10E9﹒L-1）粒細(xì)胞絕對值（10E9﹒L-1）淋巴細(xì)胞百分比（%）中間細(xì)胞百分比（%）粒細(xì)胞百分比（%）空白對照組 雄 5 7.18±0.16 18.20±1.09 40.42±3.67 1.82±0.13 0.52±0.04 38.08±3.51 4.46±0.15 1.26±0.05 94.28±0.13雌 5 7.04±0.08 19.62±1.44 40.74±1.27 1.80±0.00 0.50±0.00 38.44±1.27 4.38±0.13 1.24±0.08 94.38±0.13西藏黑木耳組 雄 5 7.00±0.21 20.01±0.89* 38.98±2.03 1.80±0.20 0.49±0.00 36.54±1.89 4.53±0.15 1.27±0.15 94.17±0.25雌 5 6.87±0.08 21.03±1.89 47.20±11.15 2.30±0.50 0.53±0.051 44.60±11.23 4.30±0.11 1.19±0.16 94.59±0.18

表6 一次性灌胃給予西藏黑木耳后大鼠的血液生化指標(biāo)測定結(jié)果（±s）

表6 一次性灌胃給予西藏黑木耳后大鼠的血液生化指標(biāo)測定結(jié)果（±s）

注：與空白對照組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

組別 性別 只數(shù)（只）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（μ﹒L-1）谷草轉(zhuǎn)氨酶（μ﹒L-1）總紅膽素（umo﹒L-1）總蛋白（g﹒L-1）白蛋白（g﹒L-1）球蛋白（g﹒L-1） （mmol﹒L-1） 膽固醇 甘油三酯（mmol﹒L-1）白球比 葡萄糖（mmol﹒L-1）空白對照組 雄 5 125.00±121.79 134.26±66.86 0.84±0.38 53.64±4.06 36.22±1.91 17.42±3.25 2.12±0.32 2.90±1.20 2.78±0.36 7.09±0.28雌 5 56.78±4.48 90.64±21.55 1.12±0.57 54.02±2.64 41.82±8.88 16.20±2.65 2.38±0.34 2.61±0.26 1.74±0.15 5.79±1.44西藏黑木耳組 雄 5 83.87±45.98 145.89±53.12 1.07±0.51 51.10±1.49 34.21±1.50 16.78±1.67 2.13±0.31 3.34±0.52 1.31±0.17** 8.32±1.76雌 5 51.98±13.86 97.01±12.01 1.30±0.8053.23±2.41 38.01±0.79 16.01±2.78 2.51±0.43 3.05±0.91 2.11±0.70 7.01±1.59

3 討論

西藏黑木耳在西藏地區(qū)廣泛使用，化學(xué)成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。劉振東等[15]通過正相硅膠柱色譜、中壓反響柱色譜、凝膠柱色譜、TLC及HPLC等技術(shù)從西藏黑木耳中分離、純化首次得到了7個單體化合物，分別為（22E,24R）-麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇（1yy2），（22E,24R）-麥角甾-5,7,22-三烯-3β-醇（Lyy3），3β,5α,9α-三羥基-7,22-（22E,24R）-麥角甾二烯-6-酮（Lyy4），5α,8α-環(huán)氧-（22E,24R）-麥角甾-6,22-二烯-3β-醇（Lyy5），5α,8α-環(huán)氧-（22E,24R）-麥角甾-6,9（11）,22-三烯-3β-醇（Lyy6），（22E,24R）-麥角甾-7,22-二烯-3β,5α,6α,9α-四醇（Lyy7），5-羥甲基-2-異丙-1-醇-2,3-二氫苯并呋喃（Lyy1）。

本文西藏黑木耳的最大給藥量為12.14g/kg，此劑量下未見動物死亡、中毒癥狀和肉眼可見的臟器異常，體重和飼料消耗量無明顯變化。其成人日用劑量為3g-10g，即上述給藥劑量為成人日用劑量73倍。結(jié)果表明，西藏黑木耳毒性低，服用安全。

此外，急性毒性實驗血液測試結(jié)果表明，與空白對照組比較，西藏黑木耳可明顯升高血液中雄性小鼠的紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞比積、血小板數(shù)、血小板比積和血小板分布寬度的含量，降低雄性小鼠的平均血紅蛋白含量以及降低血清中雄性小鼠的甘油三酯含量，但均在正常范圍內(nèi)。該變化的機(jī)制和毒效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，可能與西藏黑木耳所含某些化學(xué)成分有關(guān)，但是也可能是單次試驗的偶然現(xiàn)象，均有待進(jìn)一步研究。