多次頂空萃取-選擇離子流動(dòng)管-質(zhì)譜法測(cè)定食用油中呋喃的氣液分配系數(shù)

孫兆昱，黃雪松

(暨南大學(xué) 理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

呋喃是由食品中不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素、糖類、氨基酸、VC等營(yíng)養(yǎng)成分受熱而產(chǎn)生的，屬于可能使人體致癌的2B類致癌物，其在咖啡、醬油、嬰兒食品等食品中含量約為100 ng/mL[1]。另外，已經(jīng)證實(shí)呋喃可能是地溝油中的特征成分，可以作為鑒偽地溝油的標(biāo)志性成分之一[2]。因此，為保證食品質(zhì)量與安全、減少食品營(yíng)養(yǎng)成分的損失、鑒別食用油真?zhèn)蔚龋仨毷紫饶軌蚣皶r(shí)、快速、準(zhǔn)確地測(cè)定食品中的呋喃。

常溫下，由于呋喃是易于揮發(fā)的氣體(沸點(diǎn)31.4 ℃)，因而難以取樣和測(cè)定。美國(guó)FDA建議的方法是：采用頂空取樣、以氘代呋喃為標(biāo)樣，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定，目前測(cè)定食品中呋喃的方法都是采用該法或其改進(jìn)的辦法，如固相微萃取-GC-MS[3-4]、質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜(proton transfer reaction-mass spectrometry, PRT-MS) 等[5]。但使用這些方法時(shí)，其頂空取樣量容易受溫度、壓力、時(shí)間等多種因素的影響，尤其受呋喃在樣品與頂空中的分配系數(shù)影響，導(dǎo)致呋喃測(cè)定誤差。因此，要準(zhǔn)確定量測(cè)定食品中的呋喃等揮發(fā)物質(zhì)的含量，需首先準(zhǔn)確測(cè)定其分配系數(shù)。2007年王振東[6]等以分子拓?fù)涞姆椒▉?lái)研究烷基苯、醇、醛和烴等化合物的結(jié)構(gòu)與氣液分配系數(shù)的相關(guān)關(guān)系。2010年柳剛[7]等使用U型水銀壓力計(jì)測(cè)定了亞硝酸甲酯在甲醇溶劑中的分配系數(shù)。2011年王永華[8]等通過(guò)頂空氣相色譜法測(cè)定了海水中二甲基硫氣液分配系數(shù)。但未見(jiàn)測(cè)定食用油中呋喃等揮發(fā)性成分氣液分配系數(shù)的報(bào)道。

KOLB等報(bào)道了一種不連續(xù)氣體萃取技術(shù)[9],后被更名為多次頂空萃取(multiple headspace extraction, MHE)，其基本步驟是多次萃取頂空中的部分平衡氣體，即，在每次萃取達(dá)到平衡后測(cè)定頂空中目標(biāo)揮發(fā)物的含量，之后抽除部分頂空氣體；待樣品中氣液兩相再次充分平衡后，測(cè)定頂空氣體的目標(biāo)揮發(fā)物并重復(fù)抽除操作；該過(guò)程一般重復(fù)5次以上。根據(jù)每次測(cè)定的峰面積和測(cè)定次數(shù)之間的對(duì)數(shù)關(guān)系式計(jì)算出所測(cè)成分的分配系數(shù)。但未見(jiàn)MEH分析測(cè)定呋喃分配系數(shù)的報(bào)道。

選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜(selected ion flow tube-mass spectrometry，SIFT-MS) 是一種靈敏度高( 檢出限為10-12級(jí)) 、可以在線測(cè)定氣相中物質(zhì)成分及其絕對(duì)濃度[10]的方法，其取樣方式為頂空取樣，適宜于呋喃等揮發(fā)性物質(zhì)分配系數(shù)的測(cè)定。該方法已用以物體呼出氣體[9-12]、食品香味物質(zhì)[13-14](如葡萄酒[11]、橄欖油[12]、蘑菇[13]、果汁[14])、食品包裝材料[15]、環(huán)境中氣體[15-16]等痕量成分分析中的快速測(cè)定。本論文報(bào)道一種基于多次頂空萃取(MHE)和選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜法(簡(jiǎn)稱MHE-SIFT-MS)測(cè)定油中呋喃分配系數(shù)的方法。

1 材料與方法

1.1 依據(jù)MHE-SIFT-MS推導(dǎo)氣液分配系數(shù)方程式

1.1.1 公式推導(dǎo)法

根據(jù)MHE原理[9]，可推導(dǎo)出呋喃的分配系數(shù)K。

在恒溫封閉的氣、(油)液平衡體系內(nèi)，呋喃在體系中的總質(zhì)量為：

X0=G1+L1

(1)

式 (1)中：X0為體系內(nèi)呋喃的總質(zhì)量，G1和L1分別為第1次平衡時(shí)，呋喃在氣相和液相中的質(zhì)量。

已知K被定義為兩相濃度之比(即符合亨利定律),令濃度為C0。液相中濃度為Cl，氣相中濃度為Cg，則有：

(2)

(3)

(4)

第一次抽取氣體后，再將其進(jìn)行氣液平衡處理，即進(jìn)行第2次平衡。當(dāng)達(dá)到第2次氣液平衡后，經(jīng)測(cè)定可以求得第2次平衡時(shí)氣相中質(zhì)量(G2)為：

(5)

對(duì)于第n-1和第n次抽取和平衡時(shí)，則有關(guān)系式(6)和(7)

(6)

(7)

式(6)除以式(7)，可得式(8)：

(8)

(9)

式(9)即是MHE測(cè)定揮發(fā)性物質(zhì)分配系數(shù)的計(jì)算公式,可以將連續(xù)2次萃取平衡后的測(cè)定值代入式(9)式，即可以計(jì)算出呋喃等揮發(fā)性或半揮發(fā)性物質(zhì)在食用油等液體的液氣分配系數(shù)。

1.1.2 直接法

為比較MHE法的有效性，采用加入標(biāo)樣并測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線的辦法測(cè)定呋喃在油中的分配系數(shù)。

分別注射入空瓶體積(Vt)和另外含一定體積油(油的體積為Vl)的瓶中同樣質(zhì)量的呋喃(W)，根據(jù)SIFT-MS所測(cè)的兩者氣相呋喃濃度值(空瓶測(cè)定值為Ct,裝有油的瓶測(cè)定值為Cg)即可計(jì)算呋喃在油中的分/配系數(shù)。則有如下計(jì)算分配系數(shù)K的關(guān)系式。

W=CtVt=CgVg+ClVl

(10)

(11)

(12)

Cl為液相油脂中呋喃的濃度，將W=CtVt帶入(12)式，得：

(13)

如果油樣中如含有一定量的呋喃，仍然可以注入呋喃標(biāo)樣進(jìn)行直接測(cè)定，即將(13)式校正為(14)式：

(14)

這里的Cg0為未加入標(biāo)樣時(shí)測(cè)定的油樣氣相中的呋喃質(zhì)量濃度(與加入呋喃標(biāo)樣時(shí)氣相與液相體積相同)，并需要將Cg0換算成呋喃標(biāo)準(zhǔn)曲線條件下的質(zhì)量濃度。

1.2 材料與試劑

呋喃(分析純，99%)購(gòu)自Acros Organics公司 (USA)；澳洲堅(jiān)果油為實(shí)驗(yàn)室自制[12]，市售大豆油、花生油及冷榨橄欖油購(gòu)自俄亥俄州立大學(xué)附近的Kroger超市。

1.3 儀器與設(shè)備

Syft Voice200選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜儀(SIFT-MS, Syft VOICE-200，Syft Ltd., Christchurch, New Zealand)，Winchester恒溫水浴鍋(280 Series Water Bath, Precision Inc., USA)，Hamilton Gastight 10 μL微量注射器(Syringe, 1800 Series 1801 RN Hamilton Co., USA)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 呋喃標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取100 mg呋喃溶于100 mL冷乙醚中，獲得1 g/L 呋喃溶液，吸取5 mL該溶液稀釋至 100 mL成 50 mg/L 呋喃母液備用。

用微量注射器精確吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL母液分別注入 (540±5) mL Pyrex 1395空玻璃瓶(Corning Incorporate, USA)后，將其放入50 ℃保溫平衡1 h 待測(cè)；每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)5次，其質(zhì)量濃度平均值分別為0.092 6、0.185、0.278、0.370及0.463 ng/mL。每鍋可放入20瓶。

1.4.2 選擇適宜的平衡條件

以豆油為樣品，分別保溫平衡40、50、60、70 min，根據(jù)其頂空中的呋喃含量穩(wěn)定與否而判斷是否達(dá)到呋喃氣液平衡的條件。

1.4.3 呋喃在油中K值的測(cè)定

為驗(yàn)證MHE-SIFT-MS 法的正確性，分別采用直接法 [即式(9)]與MHE-SIFT-MS[式(14)] 2種方法進(jìn)行測(cè)定同一處理油樣瓶頂空中的呋喃濃度。對(duì)于MHE-SIFT-MS法，當(dāng)?shù)?次測(cè)定瓶中呋喃質(zhì)量濃度(該濃度用于直接法計(jì)算呋喃在油中的K)后，用注射器抽出200 mL頂空氣體，并把瓶子再放回水浴鍋中于第一次平衡時(shí)同樣的條件下保溫平衡后再行測(cè)定；同樣的方法處理5次。

1.4.4 SIFT-MS條件

Syft VOICE-200 配有v.1.4.9版軟件，采用選擇離子模式(SIM)測(cè)定，氬氣和氦氣為載氣，根據(jù)呋喃與硝基離子(NO-)的反應(yīng)速率常數(shù) (k=1.7×10-9cm3/s)，計(jì)算出所測(cè)油樣品的頂空氣體中呋喃的含量[17]。其他條件：掃描時(shí)間60 s，延遲計(jì)算時(shí)間5 s，呋喃正離子產(chǎn)生時(shí)間100 ms；反應(yīng)離子產(chǎn)生時(shí)間：前體離子25 ms；微波功率：50 W；氦載氣壓力：200 kPa；加熱進(jìn)口溫度：120℃; 空氣用作離子源氣體；氣體流量分別為2 L/s和3 L/s；樣品和毛細(xì)管的氣體流量分別為0.45 L/s和1.3 L/s；流動(dòng)真空管壓力：5.10±0.40 Pa。測(cè)定前，按照儀器使用規(guī)程，利用公司提供的標(biāo)準(zhǔn)氣體進(jìn)行精密度和精確度校驗(yàn)。

1.4.5 呋喃的測(cè)定

將5.00 g油裝入(540±5) mL玻璃瓶中，用裝有Pyrex硅橡膠內(nèi)襯墊(Lowell，MA，USA)的PTFE瓶蓋(Coring Incorporate, USA)旋緊后，置水浴鍋中保溫達(dá)到氣相平衡，取出，再用18號(hào)不銹鋼針頭穿透襯墊進(jìn)入瓶頂空中(距油樣液面約18 cm)取氣樣進(jìn)入SIFT/MS儀器中測(cè)定其呋喃濃度。為保持抽氣測(cè)定過(guò)程中的壓力平衡，插入另外一只14號(hào)16 cm長(zhǎng)不銹鋼針頭(距油樣液面約12～15 cm)。測(cè)定完后進(jìn)行下一瓶的測(cè)定。整個(gè)測(cè)定過(guò)程約2 min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。顯著水平為p≤0.05. 檢出限和定量限參考JAMES FRANCIS method[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

所測(cè)樣品中呋喃的實(shí)際含量是評(píng)價(jià)MHE-SIFT-MS法和直接法測(cè)定得到的呋喃分配系數(shù)是否正確的依據(jù)。本論文擬根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷所測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性。對(duì)所測(cè)5個(gè)點(diǎn)、均重復(fù)5次的MHE-SIFT-MS測(cè)定數(shù)據(jù)整理后，得出呋喃的標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=527.88x-6.742 4(式中，y：計(jì)算呋喃質(zhì)量濃度；x：實(shí)測(cè)呋喃濃度)，R2=0.994 2>p0.05=0.95，其5個(gè)質(zhì)量濃度的平均值分別是0.092 6、0.185、0.278、0.370、0.463 ng/mL，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別是9.1%、4.2%、2.5%、3.49%和6.70%(n=5)，其線性范圍取0.060 0～0.37 0 ng/mL，其檢出限、定量限分別是0.046和1 ng/mL，其回收率是(528±36.5)% (n=5)，比實(shí)際含量高5.28倍。該差異可能是水的次生電離所致[6]。

2.2 MHE-SIFT-MS法測(cè)定呋喃的適宜平衡條件

在MHE-SIFT-MS測(cè)定過(guò)程中，只有確保樣品中的呋喃達(dá)到氣液兩相完全平衡、才能保證測(cè)定值正確，進(jìn)而按照式(9)式獲得正確的K值。圖1顯示(540±5) mL的樣品瓶中裝有5 mL豆油時(shí)，在40、50、60、70 和80 ℃下，平衡1 h條件下所測(cè)定樣品瓶頂空中的呋喃值。

圖1 頂空中呋喃的質(zhì)量濃度隨平衡溫度的變化Fig.1 Effect of equilibration temperature on the furan concentration

從圖1可以看出：60 ℃平衡1 h，頂空中呋喃的質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，即在該條件下，樣品瓶中氣、液兩相的呋喃質(zhì)量濃度已經(jīng)分配平衡；只有在此時(shí)所測(cè)定的呋喃質(zhì)量濃度才可以用以計(jì)算其分配系數(shù)。因此，在測(cè)定呋喃在油樣中的分配系數(shù)時(shí)，應(yīng)該在60 ℃時(shí)平衡1 h后進(jìn)行MHE-SIFT-MS測(cè)定。

2.3 方法驗(yàn)證

由表1可以看出：在60 ℃平衡1 h后，采用MHE-SIFT-MS法[式(9)]測(cè)定的呋喃在澳洲堅(jiān)果油、大豆油、花生油、橄欖油中的分配系數(shù)分別為338.5、336.4、357.6、365.6，平均為(349.5±14.3)；而采用直接法[式(14)]測(cè)定這些油中呋喃的分配系數(shù)分別為328.4、318.6、342.2、357.6，其平均值為(329.4±9.7)，二者相差20.1，相對(duì)相差為5.9%?？紤]到儀器分析誤差一般為3%～6%，我們可以認(rèn)為兩種方法所測(cè)得的呋喃分配系數(shù)基本一致。也就是說(shuō)，MHE-SIFT-MS法[式(9)]與直接法[式(14)]測(cè)定的油中的呋喃分配系數(shù)無(wú)本質(zhì)差異，因?yàn)樗鼈兊挠?jì)算值基本一致(n=5)。雖然兩種方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差稍有差異，但因MHE-SIFT-MS法不需要呋喃標(biāo)準(zhǔn)品即可測(cè)定，且簡(jiǎn)單、快速，因此適用于呋喃等揮發(fā)性成分特定條件下分配系數(shù)的測(cè)定。

表1 兩種方法(公式)所測(cè)得的呋喃的分配系數(shù)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差(n=5, 60 ℃ 平衡1 h) Table 1 The partition coefficients and RSD of furan determined by two equations (n=5, equilibrated at 60 ℃ for 1 h)

2.4 分析

2.4.1 MEH-SIFT-MS法測(cè)定呋喃等揮發(fā)性成分分配系數(shù)的可靠性

本方法只是測(cè)定了部分食用油中呋喃的分配系數(shù)?？紤]到氣體在密閉體系中的分配符合亨利定律，而式(9)是根據(jù)亨利定律推導(dǎo)出的，因此可以推知，與呋喃類似的其他揮發(fā)性成分的分配系數(shù)也應(yīng)當(dāng)符合該式。

已有許多文獻(xiàn)報(bào)道MHE法測(cè)定揮發(fā)性成分分配系數(shù)的報(bào)道，該方法一般是通過(guò)不同峰面積對(duì)數(shù)值的線性回歸值，進(jìn)而計(jì)算出所測(cè)揮發(fā)性成分的分配系數(shù)。而MHE-SIFT-MS法可以直接測(cè)得出頂空(即氣相)的絕對(duì)濃度，減少了這種線性回歸方程的計(jì)算及其導(dǎo)致的誤差。另外，式(9)通過(guò)濃度比計(jì)算分配系數(shù)，可以減少或消除一些隨機(jī)誤差。表1中的RSD值較低，也間接地證實(shí)了這一點(diǎn)。

2.4.2 揮發(fā)性成分的分配系數(shù)的測(cè)定值是有條件的

測(cè)定呋喃等揮發(fā)性成分的分配系數(shù)受測(cè)定時(shí)的溫度、壓力與液相體系作用力，以及測(cè)定時(shí)的相比、平衡時(shí)間、擴(kuò)散特征和表面積等多方面的影響，在引用這些分配系數(shù)測(cè)定值時(shí)，應(yīng)當(dāng)注明這些測(cè)定條件。但很多文獻(xiàn)報(bào)道的揮發(fā)性成分分配系數(shù)值，并未包含上述測(cè)定條件。

3 結(jié)論

通過(guò)數(shù)學(xué)求證和實(shí)驗(yàn)等方法，證實(shí)MHE-SIFT-MS法可以測(cè)定封閉體系頂空中的呋喃的分配系數(shù)，該方法簡(jiǎn)單、實(shí)用，在無(wú)揮發(fā)性氣體標(biāo)樣的情況下可獲得其在特定條件下的分配系數(shù)，數(shù)學(xué)關(guān)系式可作為其他揮發(fā)性成分分配系數(shù)測(cè)定的參考。

致謝：感謝美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)系Sheryl Barringer教授給予的指導(dǎo)。

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