黃酮“落新婦苷”對胰脂肪酶抑制作用研究

鄭丹，張清峰

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西省天然產(chǎn)物與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330045)

以甘油三酯為主的食物脂肪攝入后，須通過胰和胃脂肪酶水解成單酰甘油和游離的脂肪酸后才能被吸收。脂肪酶抑制劑通過抑制胰和胃脂肪酶活性，可以減少膳食中脂肪的吸收，并通過糞便直接排泄，從而達(dá)到控制和治療肥胖的目的。脂肪酶抑制劑因不影響食欲和人體神經(jīng)系統(tǒng)，已被證實(shí)有較高安全性。因此，從天然植物中尋找安全有效的脂肪酶抑制劑成為預(yù)防和治療的肥胖熱點(diǎn)問題[1-2]。研究表明許多黃酮單體或富含黃酮的植物提取物有脂肪酶抑制活性[2-4]。

落新婦苷是一種廣泛存在于植物及其加工食品中的功能性黃酮成分，如土茯苓[5]、龜苓膏[6]、葡萄(葡萄酒)[7]、羅漢茶[8]等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)給高脂小鼠喂食土茯苓總黃酮及落新婦苷單體可顯著減少小鼠體重增幅、腹腔脂肪重量、血清中甘油三酯含量[9]。本文通過研究落新婦苷對胰脂肪酶的抑制活性，進(jìn)一步解釋其可能的作用原因。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

落新婦苷由本實(shí)驗(yàn)室從土茯苓中純化，經(jīng) UV、IR、MS 和 NMR 鑒定，純度>98%；豬胰脂肪酶，上海晶純生化科技股份有限公司；4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)，上海晶純生化科技股份有限公司；4-硝基苯酚(PNP)，上海展云化工有限公司；阿拉伯樹膠，上海青析化工科技有限公司；脫氧膽酸鈉，上海晶純生化科技股份有限公司；Tris-HCl，北京索萊寶科技有限公司。其他所用試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)主要儀器

HH-6數(shù)顯恒溫?cái)嚢柩h(huán)水箱，常州國華電器有限公司；5600型可見分光光度計(jì), 江蘇晶禾科儀廠；970CRT型熒光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑的配制

配制50 mmol/L pH 8.0的Tris緩沖液，并加入0.1%阿拉伯樹膠粉和0.2% 脫氧膽酸鈉。用Tris緩沖液配制1.2 mg/mL的胰脂肪酶溶液，混勻后5 000 r/min離心取上清液。精確稱取22.5 mg落新婦苷用60%乙醇溶解至5 mL，再取1 mL用Tris緩沖液稀釋至10 mL得到1 mmol/L的落新婦苷溶液。底物PNPP先溶于無水乙醇，再用Tris-HCl緩沖液稀釋，最終濃度為0.2 mmol/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%。

1.3.2 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取PNP，用乙醇配成濃度為5 mmol/L的母液，后用Tris緩沖液分別稀釋至0.01、0.025、0.04、0.05、0.075 mmol/L, 測定其在405 nm處的吸光度。以PNP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為Y=16.908X+0.017 5，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4。

1.3.3 最適胰脂肪酶反應(yīng)體系建立

將胰脂肪酶溶液，底物溶液以及緩沖液在37 ℃水浴中保溫10 min，分別取0.5 mL Tris緩沖液(pH 8.0)和胰脂肪酶溶液，再加入1 mL底物PNPP溶液，混勻后反應(yīng)不同時(shí)間(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 min)，然后在405 nm波長下測定吸光度。以0 min時(shí)混合液的吸光度為空白，每組做3個(gè)平行，找出最適反應(yīng)時(shí)間。在最適反應(yīng)時(shí)間下，改變緩沖液pH(6.0、7.0、8.0)和水浴溫度(25、37 ℃)，找出最適反應(yīng)溫度和pH。

1.3.4 落新婦苷與胰脂肪酶作用時(shí)間對其抑制作用的影響

在37 ℃水浴中保溫10 min后，分別移取0.3 mL Tris緩沖液、0.2 mL落新婦苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液于試管中，混勻后在37 ℃水浴中分別靜置0、2、4、6、8、10 min后，再加入1 mL PNPP底物溶液，37 ℃水浴反應(yīng)20 min后測定405 nm處吸光度A1；將落新婦苷溶液換為緩沖液得到吸光度A2；以加入PNPP后反應(yīng)0 min時(shí)吸光度為A0(空白)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算抑制率，如公式(1)所示：

(1)

1.3.5 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑制作用的影響

在37 ℃水浴中保溫10 min后，分別移取0.3 mL 緩沖液、0.2 mL不同濃度落新婦苷溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mmol/L)、0.5 mL胰脂肪酶溶液于試管中，混勻后在37 ℃水浴中靜置10 min，再加入1 mL PNPP底物溶液，在37 ℃水浴中反應(yīng)20 min后，在405 nm波長下測定其吸光度。按1.3.4計(jì)算抑制率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.6 落新婦苷抑制胰脂肪酶的動(dòng)力學(xué)特征

在37 ℃水浴中保溫10 min后，分別吸取0.3 mLTris緩沖液、0.2 mL落新婦苷溶液、0.5 mL胰脂肪酶溶液，再加入1 mL不同濃度的底物PNPP溶液(0.05～0.5 mmol/L)，37 ℃水浴反應(yīng)20 min后，測定405 nm吸光度，扣除空白后根據(jù)PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算PNP生成量，再除以反應(yīng)時(shí)間20 min，得到酶促反應(yīng)速度，按照Lineweaver-Burk 的雙倒數(shù)作圖法，確定抑制作用的類型。

1.3.7 熒光光譜滴定法測定落新婦苷與胰脂肪酶的相互作用

將落新婦苷(0.01 mol/L)用Tris緩沖液稀釋100倍后，分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL于5 mL比色管中，再各加入1 mL胰脂肪酶溶液，最后用Tris緩沖液定容至5 mL。搖勻后測定熒光強(qiáng)度，設(shè)定激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長掃描范圍為280～450 nm，靈敏度為2，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為10 nm。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，取平均值，使用origin 8.0 (Origin Lab Co., Northampton,MA, USA)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析、繪圖和曲線擬合。

2 結(jié)果與討論

2.1 最適胰脂肪酶反應(yīng)體系建立

胰脂肪酶可以將底物PNPP水解，產(chǎn)物為PNP和棕櫚酸，PNP在405 nm處有最大吸收，因此可以通過測定405 nm處的吸光度反映酶活力。酶促反應(yīng)速度需要在底物充足的情況下測定，因?yàn)樵谝粋€(gè)封閉的反應(yīng)體系中，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，底物逐漸被消耗，底物不足會(huì)使酶促反應(yīng)速度逐漸下降。由圖1可知，在0～20 min內(nèi)吸光度隨時(shí)間的延長線性增大，說明在此時(shí)間段底物是充足的，酶促反應(yīng)速度恒定；20 min之后，吸光度的增長速率逐漸減慢，說明底物不充足，酶促反應(yīng)速度下降。因此選擇反應(yīng)時(shí)間為20 min。

圖1 最適胰脂肪酶反應(yīng)時(shí)間確定Fig.1 The optimal reaction time of pancreatic lipase

改變反應(yīng)體系的pH值為6.0、7.0和8.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pH值為7.0時(shí)反應(yīng)速度很慢，在pH 6.0時(shí)幾乎不反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)溫度設(shè)置為25 ℃時(shí)，反應(yīng)速度變得很慢。因此，本實(shí)驗(yàn)的最佳反應(yīng)體系確定為pH 8.0、37 ℃下反應(yīng)20 min。

2.2 落新婦苷與胰脂肪酶作用時(shí)間對抑制作用的影響

恒定落新婦苷的濃度為100 μmol/L，圖2為落新婦苷與胰脂肪酶作用不同時(shí)間對其抑制作用的影響。結(jié)果表明，隨著落新婦苷與胰脂肪酶作用時(shí)間的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，說明二者的結(jié)合需要一定的時(shí)間。王詩卉等在研究兒茶素(EGCG)對胰脂肪酶抑制作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，EGCG與胰脂肪酶剛混合時(shí)，抑制作用很差；抑制率隨兩者作用時(shí)間的延長逐漸增強(qiáng)[10]。根據(jù)圖2，確定落新婦苷與胰脂肪酶作用時(shí)間為10 min。

圖2 不同作用時(shí)間對胰脂肪酶抑制作用的影響Fig.2 The effects of interaction time between astilbin and pancreatic lipase on the inhibition rate

2.3 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑制作用的影響

圖3為不同濃度的落新婦苷對胰脂肪酶的抑制效果。在0～20 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著落新婦苷濃度的增加抑制率快速增加；此后繼續(xù)增加落新婦苷濃度，抑制率趨于穩(wěn)定。濃度為120 μmol/L時(shí)，落新婦苷對胰脂肪酶的抑制率為56.3%。根據(jù)曲線，落新婦苷對胰脂肪酶的半抑制率濃度大約為105 μmol/L。張晨辰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L條件下，槲皮素對胰脂肪酶活性的抑制率為65.5%；其他許多黃酮化合物如高良姜精，黃芩素，蕓香葉苷等都可有效抑制胰脂肪酶活性，提示黃酮類化合物有可能成為新型的胰脂酶抑制劑。

圖3 落新婦苷濃度對胰脂肪酶抑制作用的影響Fig.3 The effects of astilbin concentration on the inhibition of pancrelipase

2.4 落新婦苷抑制胰脂肪酶的酶動(dòng)力學(xué)特征

根據(jù)酶與抑制劑相互作用方式，可逆抑制作用有競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制等3種形式。競爭性抑制是抑制劑與底物競爭與酶活性中心結(jié)合從而使酶活性降低, 酶動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為米氏常數(shù)(Km)增大，而最大反應(yīng)速度(vmax)不變。非競爭性抑制指抑制劑與酶活性中心以外的其他部位結(jié)合，從而使酶的催化活性降低，酶動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為vmax變小，但Km不變。改變底物PNPP的濃度[S]，測定得到有無落新婦苷條件下對應(yīng)的酶促反應(yīng)速度v，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程，以1/[S]對應(yīng)1/v作圖，得到圖4。落新婦苷不改變胰脂肪酶與底物的親和程度, 即Km值不變，但vmax減小，說明落新婦苷是胰脂肪酶非競爭性抑制劑。落新婦苷與胰脂肪酶活性中心以外的其他部位結(jié)合，這種結(jié)合不影響酶活性中心與底物的結(jié)合，因此Km值不變，但酶-底物-抑制劑三者復(fù)合物不能分解為產(chǎn)物PNP，因此vmax減小。

圖4 落新婦苷抑制胰脂肪酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程擬合曲線Fig.4 Fitting curve of Lineweaver-Burk double reciprocal equation of astilbin inhibition of pancreatic lipase

2.5 熒光光譜法分析落新婦苷對胰脂肪酶結(jié)合作用

胰脂肪酶中含有色氨酸殘基，可以發(fā)射熒光。圖5為脂肪酶的熒光發(fā)射光譜，脂肪酶的最大激發(fā)波長為280 nm，最大發(fā)射波長為341 nm。加入落新婦苷會(huì)使胰脂肪酶的內(nèi)源熒光強(qiáng)度有規(guī)律的降低，即發(fā)生熒光淬滅現(xiàn)象，并使其最大發(fā)射波長向長波方向移動(dòng)至356 nm，說明二者有相互結(jié)合作用?？赏ㄟ^公式(2)來計(jì)算落新婦苷與落新婦苷之間的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[13]。

(2)

圖5 落新婦苷對胰脂肪酶熒光光譜的影響Fig.5 The effect of astilbin on fluorescence emission spectra of pancreatic lipase注：1～9中落新婦苷質(zhì)量濃度分別為0,2,4,6,8,10,12,14,16,18 μmol/L

圖和lgcq線性回歸曲線Fig.6 The linear graphs of lg and lgcq

3 結(jié)論

黃酮“落新婦苷”對胰脂肪酶有一定的抑制作用，半抑制率濃度為105 μmol/L，最大抑制率為56.3%；且抑制效果隨二者作用時(shí)間延長而增強(qiáng)。落新婦苷不改變胰脂肪酶與底物的親和程度，但使其最大反應(yīng)速度減小，是胰脂肪酶的非競爭性抑制劑。熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)表明落新婦苷可與胰脂肪酶結(jié)合，二者結(jié)合常數(shù)lgKa為5.50，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為1.17。本研究結(jié)果表明落新婦苷可以抑制胰脂肪酶活性，這可能是其有脂肪代謝調(diào)節(jié)作用的機(jī)制之一。

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