醬香型白酒釀造過程中厭氧細菌的分離鑒定

王曉丹，白小燕，曾超，雷安亮，邱樹毅*

1(貴州大學(xué),貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025) 2(貴州珍酒釀酒有限責(zé)任公司，貴州 遵義，563003) 3(貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽，550025) 4(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽，550025)

醬香型白酒是將高粱粉碎加大曲投入到深3 m的長方形窖池，用泥土密封進行發(fā)酵。發(fā)酵經(jīng)過9個輪次，每輪次歷時1個月。糟醅在窖池中分為上中下3層，從窖池底部往上0.1～0.3 m為下層，從窖池頂部往下0.1～0.3 m為上層，其余為中層。同一輪次酒窖不同位置的發(fā)酵酒醅，所產(chǎn)酒的質(zhì)量跟風(fēng)格也有所差異，可分為醬香、醇甜和窖底香3個單型酒[1]。厭氧菌是一類在無氧條件下比在有氧環(huán)境中生長好的細菌，窖池的底部酒醅與窖底泥中的微生物進行相互滲透和作用，逐漸形成了獨有的厭氧微生物體系，這個體系在發(fā)酵過程中必然發(fā)揮著重要的作用。這類細菌缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無氧發(fā)酵的方式進行，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙醇、乳酸、己酸等[2]。在對濃香型白酒發(fā)酵的研究中發(fā)現(xiàn)，酒醅入窖發(fā)酵，窖泥中的厭氧細菌對酒醅的糖化、乙醇的產(chǎn)生等起作用，其代謝產(chǎn)生的窖香香氣是構(gòu)成濃香型白酒窖香濃郁的重要組成部分[3]；另外，從汾酒的窖泥底分離純化得到的菌株腸球菌科(Enterococcaceae)也是白酒釀造過程中酒醅中常見的微生物類群[4]。對醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析及窖池底部的微生物類群進行研究發(fā)現(xiàn)，微生物數(shù)量以細菌和真菌為主，酵母含量最低,且厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群[5-6]。通過對茅臺酒發(fā)酵窖池中的窖底泥及環(huán)境土樣中的微生物區(qū)系構(gòu)成進行測序分析，發(fā)現(xiàn)在將土壤馴化成窖底泥的過程中，乳桿菌科(Lactobacillaceae)、梭菌科(Clostridi-aceae)和胃瘤球菌科(Ruminococcaceae)等厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群[3]。

醬香型白酒經(jīng)過長達1年的生產(chǎn)周期，發(fā)酵環(huán)境中的厭氧微生物的代謝就必然會影響釀酒體系中的各項指標和白酒的風(fēng)味。由此可見，研究醬香型白酒酒醅發(fā)酵過程中下層酒醅厭氧細菌的數(shù)量變化對生產(chǎn)過程的影響以及厭氧細菌的種類是很有必要的。本文以整個發(fā)酵周期的窖池底部酒醅為研究對象，對厭氧細菌數(shù)量進行跟蹤，討論酒醅水分、酸度、還原糖和厭氧微生物數(shù)量的關(guān)系，并建立一種操作簡便、有效的厭氧細菌分離篩選方法，為進一步討論其功能與白酒釀造的關(guān)系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品來源于貴州珍酒釀酒有限公司的生產(chǎn)車間23班7號窖池。對窖池下層酒醅進行取樣，取樣時間為2014年11月～2015年9月。醬香型白酒釀酒工藝及取樣位置如圖1。

1.2 取樣

將具有丁基橡膠內(nèi)塞和塑料外塞的血清瓶經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min后于烘箱中充分晾干。

圖1 醬香型白酒生產(chǎn)工藝流程圖Fig.1 Maotai-flavor liquor production flow chart

然后于超凈臺內(nèi)充滿N2，迅速蓋上瓶內(nèi)塞密封，用外塞旋緊固定。對釀造工藝過程中的下沙、糙沙及3～7輪次酒醅入窖發(fā)酵結(jié)束后進行取樣，取樣對象為距離窖池底部0.1～0.2 m的下層酒醅。取樣時迅速打開藍蓋瓶，快速對同區(qū)域3點進行取樣，混合均勻，排除瓶內(nèi)的空氣，利用冰塊保護。

1.3 培養(yǎng)基的配制

1.3.1 厭氧培養(yǎng)液

用于厭氧菌增菌培養(yǎng)。KH2PO40.176 g，K2HPO40.293 g，NaCl 0.443 g，(NH4)2SO40.45 g，CaCl 0.045 g，MgSO40.094 g，刃天青0.001 g，L-半胱氨酸0.5 g，L-抗壞血酸0.5 g，Na2CO34.0 g，牛膽鹽，1.0 g，蛋白胨1.0 g，瓊脂1.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5～8.0。其中刃天青作為厭氧指示劑，它在氧化態(tài)時呈紫色，在無氧狀態(tài)時，即完全還原時呈無色[7]。

1.3.2 厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基

用于厭氧菌分離培養(yǎng)。胰酪蛋白胨20.0 g，NaCl 5.0 g，L-胱氨酸0.4 g，葡萄糖10.0 g，硫代乙醇酸鈉2.0 g，甲醛合次硫酸氫鈉1.0 g，美藍0.002 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.5。其中L-半胱氨酸作為還原劑，除去溶解于厭氧培養(yǎng)液中的氧氣，用于厭氧菌的富集和液體培養(yǎng)[7]。

1.3.3 生理生化培養(yǎng)基[8-9]

革蘭氏染色：(1)草酸銨結(jié)晶紫染劑：溶液I(結(jié)晶紫2.0 g，體積分數(shù)為95%的酒精20.0 mL)與溶液II[(NH4)2C2O40.8 g，蒸餾水80.0 mL]分別配成并混合。(2)魯戈爾碘液：I21.0 g，KI 2.0 g，蒸餾水300.0 mL；I2和KI在研缽中充分研磨并溶于水，然后儲放在有色磨口玻璃瓶中，防止光解。(3)番紅復(fù)染劑：2.5%番紅，95%酒精溶液10.0 mL，蒸餾水100.0 mL。

甲基紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡糖糖5 g，K2HPO45 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硫化氫試驗培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨10 g，F(xiàn)eSO40.2 g，NaS20.3 g，NaCl 5 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL。

氧化酶試驗培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)液培養(yǎng)基。

吲哚試驗培養(yǎng)基：蛋白胨液體培養(yǎng)基。

檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)基：NaCl 5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g， (NH4)H2PO41 g，檸檬酸鈉5.0 g，K2HPO41 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，0.2%溴麝香草酚藍40 mL，pH 6.8。

V-P試驗培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

硝酸鹽還原試驗培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基1 000 mL，KON31 g，pH 7.0～7.6

接觸酶試驗培養(yǎng)基：厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基。

耐鹽試驗培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，NaCl(20，50，70，100 g/L)，pH 7.0～7.2。

淀粉水解試驗培養(yǎng)基：牛肉膏2.0 g，蛋白胨17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂17.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

葡萄糖產(chǎn)酸試驗培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 3 g，Na2HPO4·12H2O 2 g，0.2%溴麝香草酚藍溶液12 mL，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4，加入0.5%葡萄糖。

葡萄糖產(chǎn)氣試驗培養(yǎng)基：厭氧培養(yǎng)液

1.4 厭氧細菌的培養(yǎng)計數(shù)

10 g酒醅于含90 mL無菌水的三角瓶中，在厭氧工作站中充分振蕩，靜置，取上清液1 mL于厭氧培養(yǎng)基的平板中，36 ℃，濕度60%，厭氧工作站中通入混合氣體：10% H2，10% CO2，80% N2，倒置培養(yǎng)3 d，采用平板計數(shù)法計數(shù)。

1.5 酒醅理化指標的檢測

水分測定見文獻[10]，酸度測定見文獻[11]，還原糖測定見文獻[12]。

1.6 厭氧細菌的分離篩選

1.6.1 厭氧菌的富集

在氮氣流下，稱取10 g酒醅加入滅完菌的90 mL生理鹽水(9 g/L NaCl+0.2 g/LL-半胱氨酸)于厭氧瓶中，迅速蓋緊瓶蓋，在37 ℃，180 r/min搖床上振蕩20 min，取出放入?yún)捬豕ぷ髡局?，吸?.1 mL上清液加入滅菌后的厭氧培養(yǎng)液中進行厭氧菌富集培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h，去除樣品中的好氧菌，使厭氧菌大量繁殖。

1.6.2 厭氧菌的分離和純化[13]

在厭氧工作站中將富集培養(yǎng)后的菌懸液分別稀釋到10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。每個稀釋度取0.2 mL涂平板，3個平行，在37 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。長出菌落后，選擇合適的梯度，根據(jù)菌落的大小、形態(tài)、顏色、透明度、是否隆起等形態(tài)學(xué)特征挑取不同的單菌落，劃線純化。

嚴格厭氧菌的篩選：在厭氧工作站中，將已純化的菌種接種到厭氧菌瓊脂上，分別放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱和37 ℃厭氧工作站中培養(yǎng)3 d，觀察。若在生化培養(yǎng)箱和厭氧工作箱中均生長，則為兼性厭氧菌，在厭氧培養(yǎng)箱中生長而在生化培養(yǎng)箱中不生長，則為嚴格厭氧菌。

1.7 形態(tài)學(xué)特征及生化反應(yīng)實驗

挑取少許細菌接種于厭氧培養(yǎng)基平板上，在35 ℃條件下培養(yǎng)3 d，根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》記錄菌落形態(tài)及掃描電子顯微鏡形態(tài)，并測定細菌大小，進行形態(tài)學(xué)鑒定。對分離的細菌做生理生化鑒定，方法參見《伯杰氏細菌鑒定手冊》及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。

掃描電子顯微鏡鏡檢方法：取培養(yǎng)3 d的菌懸液1 mL于離心管中，再加入1 mL 2.5%戊二醛，4 ℃固定20 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)清洗2次；在26 ℃用30%、50%、70%、90%的叔丁醇/無水乙醇混合液各脫水5 min；抽干離心管中叔丁醇，真空冷凍干燥50 min；將樣品用導(dǎo)電膠粘在樣品臺上，離子濺射儀鍍金膜，掃描電鏡觀察并拍照[14]。

1.8 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)細菌DNA提取試劑盒方法提取已分離的厭氧細菌DNA。采用細菌16S rDNA通用引物27f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，對應(yīng)于Escherichiacoli16S rDNA(8-27位)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，對應(yīng)于E.coli16S rDNA的(1 510～1 492位) 進行擴增，該對引物幾乎能擴增出近乎細菌DNA全長的16S rDNA序列，長度約1 450 bp左右。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：在25.0 μL Mix 12.5 μL，10 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，細菌DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL[14]。PCR擴增條件為，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min, 72 ℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，最后72 ℃保持10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物于1% 瓊脂糖凝膠50 V電泳20 min左右。在凝膠成像儀下觀察。若有條帶，剩余PCR產(chǎn)物送上海生物公司有限公司測序。

1.9 DNA序列分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)過Blast比對后，下載每株細菌相似性大于99%的幾株細菌序列，并下載芽孢桿菌科各屬模式菌株系列，以Escherichiacoli為外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用MEGA5.05進行序列比對，并手工校正，用鄰接法(NJ)[16]，經(jīng)1 000次bootstrap進行驗證。

2 結(jié)果及分析

2.1 厭氧細菌數(shù)量變化

窖池下層酒醅中厭氧細菌數(shù)量變化如圖2。厭氧細菌數(shù)量在104～105之間波動變化。糧食第1次入窖(下沙階段)窖池厭氧微生物的數(shù)量最多，達到2.2×105CFU/g;在糧食第2次入窖(糙沙階段),微生物數(shù)量明顯下降，直至7次取樣下降了100倍。通過對醬香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，微生物數(shù)量以細菌和真菌為主,酵母含量最低,且厭氧微生物逐漸成為主要優(yōu)勢種群[2]。隨著發(fā)酵的進行，窖池內(nèi)酒醅含氧量、酒醅質(zhì)地疏松情況、水分含量等發(fā)生變化，不利于厭氧細菌的繁殖，在糙沙階段以后厭氧菌數(shù)量明顯減少。在濃香型白酒生產(chǎn)中，窖底泥存在大量的厭氧細菌和厭氧芽孢細菌，同時厭氧菌缺乏超氧化物歧化酶等而極易受到氧氣的毒害，長時間暴露于空氣中甚至?xí)劳?，酒醅里的厭氧細菌主要是來源于窖底[17]。

酒醅的發(fā)酵過程是多種微生物和酶系共同作用的一個非常復(fù)雜的過程。水分、酸度、糖分等因素對微生物代謝具有極大的影響，從而影響微生物數(shù)量。酒醅水分多少關(guān)系著微生物的代謝，影響發(fā)酵的程度，最終決定酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。隨著發(fā)酵的進行，水分逐漸上升(圖2-B)，厭氧細菌數(shù)下降。這是因為隨著發(fā)酵的進行，生成乙醇的同時，水分含量也會不斷增加，糖化發(fā)酵作用快，升酸快，抑制細菌的生長，導(dǎo)致厭氧細菌數(shù)量減小[18]。

圖2 酒醅厭氧細菌數(shù)量(A)，水分含量(B)，酸度(C)和還原糖含量(D)的變化Fig.2 The change of anaerobic bacteria quantity(A), water content(B),acidity(C) and reducing sugar content(D) in fermented grains

酒醅發(fā)酵需要適宜的酸度。適宜的酸度可以抑制部分有害雜菌的生長繁殖，起到以酸制酸的作用。而酸度過高又會抑制有益微生物的生長繁殖，影響酒醅正常發(fā)酵，導(dǎo)致產(chǎn)量和質(zhì)量的下降[19]。醬香型白酒窖池下層酒醅酸度變化見圖2-C，酸度變化與厭氧細菌數(shù)量呈極顯著負相關(guān)關(guān)系，隨著酸度的上升厭氧細菌數(shù)量遞減。這可能是由于隨著總酸量的增多，窖池環(huán)境的改變，不適合許多微生物生存，導(dǎo)致細菌多樣性指數(shù)下降[20]。

酒醅中還原糖濃度的變化，影響著微生物的代謝，微妙反映了糖化與發(fā)酵的平衡關(guān)系[19]。這可能是由于發(fā)酵初期微生物將淀粉分解為還原糖，細菌大量繁殖；但隨著發(fā)酵的進行還原糖最終被消耗，細菌數(shù)量不斷減少[20](圖2-C)。

2.2 厭氧細菌的分離篩選鑒定

2.2.1 酒醅中厭氧細菌的分離與純化

通過對酒醅菌懸液的富集，厭氧分離純化培養(yǎng)，從酒醅樣品中分離得到4株嚴格厭氧細菌,分別編號為JP1，JP2，JP3，JP4。形態(tài)描述(表1)及電子顯微鏡鏡檢見圖3。

表1 厭氧細菌菌落形態(tài)描述Table 1 The morphologicalcolony description of anaerobic bacteria

觀察細菌顯微結(jié)構(gòu)特征如下：

JP1：桿菌，0.6～8.0 μm，孢子橢圓或卵圓。

JP2：直或微彎的桿菌，0.6～7.0 μm，端圓，單個、成對、短鏈；與《伯杰細菌鑒定手冊》上描述的丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有較高相似度。

JP3：桿菌，0.5～4.4 μm，孢子卵圓，無附屬絲；與《伯杰細菌鑒定手冊》上描述的近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有較高相似度。

圖3 掃描電子顯微鏡形態(tài)觀察Fig.3 SEM observation of the morphological characteristics

JP4：直到微彎的桿菌，0.6～8.0 μm，孢子卵圓、端生。細菌的生理生化鑒定與《伯杰細菌鑒定手冊》上描述的煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有較高相似度。

2.2.2 厭氧細菌的鑒定

試驗對4株已純化的厭氧細菌進行生理生化鑒定，結(jié)果見表2。甲基紅實驗呈陽性，說明細菌能利用葡萄糖；硫化氫實驗呈陽性，能分解含硫氨基酸；氧化酶實驗呈陽性，細菌具有氧化酶；吲哚實驗呈陽性，細菌具有色氨酸酶；檸檬酸鹽實驗均呈陽性，細菌能利用檸檬酸鹽；V-P實驗呈陽性，細菌能利用葡萄糖；硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽性，細菌能還原硝酸鹽；接觸酶實驗呈陽性，細菌具有過氧化氫酶；耐鹽試驗均呈陽性，細菌能耐鹽；淀粉水解實驗均呈陽性，細菌能水解淀粉；產(chǎn)酸、產(chǎn)氣呈陽性，細菌能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體；以上呈陰性則相反。JP1、JP2、JP3、JP4這些細菌均為革蘭氏陽性，都能利用檸檬酸鹽，都能耐鹽，都能水解淀粉。JP1能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，具有氧化酶，不能還原硝酸鹽，具有過氧化氫酶，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見《伯杰細菌鑒定手冊》，該菌與解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)具有較高相似度。JP2能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能還原硝酸鹽，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，不能產(chǎn)生氣體。參見《伯杰細菌鑒定手冊》，該菌與丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)具有較高相似度。JP3不能利用葡萄糖，能分解含硫氨基酸，具有色氨酸酶，能還原硝酸鹽，具有過氧化氫酶，能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見《伯杰細菌鑒定手冊》，該菌與近端梭菌(Clostridiumsubterminate)具有較高相似度。JP4能利用葡萄糖，不能分解含硫氨基酸，不能還原硝酸鹽，具有過氧化氫酶，不能產(chǎn)生酸性物質(zhì)，能產(chǎn)生氣體。參見《伯杰細菌鑒定手冊》，該菌與煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)具有較高相似度。

表2 厭氧細菌生理生化鑒定Table 2 The physiological and biochemical identification of anaerobic bacteria

注：+表示陽性；-表示陰性。

2.2.3 16S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育分析

基于細菌16S DNA對4株細菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4 厭氧細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of anaerobic bacteria

結(jié)合表1、表2、圖3、圖4的結(jié)論，最終將JP1鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)，JP2鑒定為丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，JP3鑒定為近端梭菌(Clostridiumsubterminate)，JP4鑒定為煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)。在采用PCR-DGGE技術(shù)探索濃香型白酒不同窖齡窖泥細菌類群也有發(fā)現(xiàn)Clostridiumbutyricum和Clostridiumsartagoforme[21]。C.butyricum一般存在于人或動物的腸道中的嚴格厭氧菌，能促進有益的雙歧桿菌、乳酸菌、擬桿菌的增殖作用，也能有效地抑制引起疾病的細菌的繁殖[22]。早在1990年在采用甲烷菌、己酸菌二元發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)窖泥時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C.xylanolyticum與C.subterminate具有互利共生的關(guān)系，在窖泥反應(yīng)中，2株菌的數(shù)量都有所增加[23]，可以提高瀘型曲酒的質(zhì)量。目前，利用己酸菌培窖的微生物技術(shù)已經(jīng)在全國范圍內(nèi)推廣[24]，瀘州老窖酒曲的中試驗結(jié)果表明，利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵能夠提高酒體中己酸乙酯的含量[25]，若以100 mL酒體中含有己酸乙酯180 mg計，其優(yōu)質(zhì)品率可達到總出酒量的80.9%?？梢?，在白酒釀造體系中，厭氧微生物能有效提高白酒質(zhì)量，提高總出酒量的優(yōu)質(zhì)率。

厭氧微生物的培養(yǎng)的一個關(guān)鍵性問題就是厭氧條件是否合格,只有厭氧條件合格才能提高厭氧菌的分離率[26]。目前厭氧微生物的培養(yǎng)技術(shù)主要有平板厭氧技術(shù)(主要包括平皿夾層厭氧法、平板培養(yǎng)瓶厭氧技術(shù))[10]、亨蓋特(Hungate)滾管技術(shù)[27]、厭氧手套箱技術(shù)[28-29]。本實驗在AG300厭氧工作站中操作完成，該工作站操作簡單，能夠克服厭氧環(huán)境難以形成的問題，操作及其培養(yǎng)都在厭氧手套箱中，能夠直接通過手與儀器接觸進行操作，較傳統(tǒng)方法更容易培養(yǎng)出嚴格厭氧菌。該方法適用于傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵過程中厭氧細菌的分離純化。

3 結(jié)論

通過對窖池底部厭氧細菌數(shù)量的計數(shù)，菌量從105下降到103，隨著發(fā)酵過程中水分、還原糖、酸度的變化，厭氧微生物的變化明顯。采用AG300厭氧工作站培養(yǎng)技術(shù)完成了醬香型白酒底層酒醅中厭氧微生物的分離純化，共篩選到嚴格厭氧菌4株。分別鑒定為解木聚糖梭菌(Clotridiumxylanolyticum)、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、近端梭菌(Clostridiumsubterminate)和煎盤梭菌(Clostridiumsartagoforme)。

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