α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶在畢赤酵母中的表達(dá)及其對大麥麥芽過濾性能的影響

解西柱，張明，林材，蔡國林，吳殿輝，李曉敏，陸健*

1 (江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 3 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 4(江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司，江蘇 射陽，224300) 5 (華潤雪花啤酒有限公司，河北 秦皇島，066001)

阿拉伯木聚糖(arabinoxylans，AX )是半纖維素的主要成分，其基本結(jié)構(gòu)是以β-(1→4)-D吡喃木糖殘基為線形骨架，同時(shí)在C(O)-3，(O)-2或C(O)-2，3鍵聯(lián)上α-L-阿拉伯呋喃糖殘基為側(cè)鏈取代基[1]。AX的降解需要多種酶的協(xié)同作用，如內(nèi)切β-木聚糖酶、外切β-木聚糖酶、β-木糖苷酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶等[2-3]。在大麥麥芽中AX的含量為3.1%～4.0%，水溶性阿拉伯木聚糖(water-extractable arabinoxylans, WEAX)的含量為0.49%～0.69%[4]。AX的存在在麥汁的制造過程中會(huì)產(chǎn)生很多問題，尤其是多聚阿拉伯木聚糖(polymeric arabinoxylans, PAX)，比如降低麥汁的過濾速度，增加麥汁的黏度等[5]。但在AX的降解過程中，L-阿拉伯呋喃糖殘基的存在阻礙了其他水解酶與AX的有效結(jié)合，進(jìn)而降低了水解酶對AX的降解效率，影響麥汁的過濾性能[6-7]。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-Arabinofuranosidase, AnabfA)存在于糖基水解酶的第3、43、51、54、62和127家族[8]。它可特異性地從L-阿拉伯糖多糖或寡糖殘基的非還原末端α-L-1,2-，α-L-1,3-和α-L-1,5-位點(diǎn)水解生成1個(gè)阿拉伯糖[9-11]。AnabfA已經(jīng)在一些細(xì)菌、真菌和植物中獲得，但由于酶活較低，不具備工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。目前，國內(nèi)外一些研究人員已經(jīng)在大腸桿菌和酵母等菌株中進(jìn)行異源表達(dá)，在國內(nèi)，薛業(yè)敏等首次實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中對AnabfA的異源表達(dá)[12]，獲得耐熱性較好的阿拉伯糖苷酶。而且，國內(nèi)外研究人員也實(shí)現(xiàn)了AnabfA在酵母中的異源表達(dá)[13-17]，但酶學(xué)性質(zhì)及酶活存在較大的差異。目前，國內(nèi)外對AnabfA的研究重視程度不夠，尚未有商品化的酶問世，而且對AnabfA的應(yīng)用研究也比較少。

本研究從NCBI上查詢獲得黑曲霉AnabfA的基因序列，通過PCR技術(shù)從黑曲霉基因組中擴(kuò)增獲得AnabfA的基因。構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-QAnabfA，并在畢赤酵母X-33中誘導(dǎo)表達(dá)，研究重組AnabfA的酶學(xué)性質(zhì)及其對大麥麥芽過濾性能的影響，為AnabfA的工業(yè)應(yīng)用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

AspergillusnigerCBS513.88，PichiapastorisX-33，E.coliJM109均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；質(zhì)粒pMD18-T simple vector，pPICZαA均購自于TaKaRa公司。

1.1.2 主要酶、試劑

肽N-糖苷酶F，O-Glycosidase購于New England Biolabs(NEB)公司，DNA限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，rTaq酶，高保真DNA聚合酶，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒，購于TaKaRa公司；博萊霉素(zeocin)，蛋白質(zhì)Marker ，購于BBI生命科學(xué)有限公司；對硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(4-Nitrophenyl α-L-arabinofuranoside， 簡稱pNPAF)購于Sigma公司；木聚糖酶(xylanase, Xyn)購于白銀賽諾生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀， 美國Bio-Rad公司；JD-801凝膠成像儀，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；Spectra Max Plus 384酶標(biāo)儀，美國MDC公司；HisTrapTMexcel(1 mL)色譜柱，GE Healthcare公司；Mastercycler pro PCR儀，德國Eppendorf公司，EBC-LF麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī)，北京德之杰公司；WGZ-2-PJ濁度計(jì)，上海昕瑞儀器儀表有限公司；黏度計(jì)，Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 黑曲霉AnabfA基因的分析與克隆

利用液氮研磨的方法[18]提取黑曲霉的基因組。從GenBank查詢獲得AnabfA的基因序列，利用信號肽預(yù)測軟件SignaIP 3.0在線預(yù)測AnabfA的信號肽序列，設(shè)計(jì)引物P1、P2、P3、P4，引物序列如表1所示。以黑曲霉的基因組為模版，利用重疊PCR技術(shù)去除AnabfA的信號肽、內(nèi)含子和終止密碼子序列獲得目的基因片段QAnabfA[19-20]。將QAnabfA與T載體pMD18-T連接得到重組質(zhì)粒QAnabfA-T，并轉(zhuǎn)化E.coliJM109進(jìn)行保藏。

表1 PCR反應(yīng)引物Table 1 PCR priers

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

EcoR I和NotI對質(zhì)粒pPICZαA和QAnabfA-T進(jìn)行雙酶切，T4DNA連接酶連接雙酶切產(chǎn)物，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-QAnabfA (圖1)。EcoR I和NotI對陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證其是否正確連接。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIZαA-QAnabfA的構(gòu)建圖譜Fig.1 Construction of recombinant expression plasmid pPIZαA-QAnabfA

1.2.3 重組AnabfA的誘導(dǎo)表達(dá)及其分離純化

通過電轉(zhuǎn)化的方法分別把重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-QAnabfA和空載表達(dá)載體pPICZαA轉(zhuǎn)入到畢赤酵母X-33中，篩選獲得重組子。用培養(yǎng)基BMGY對重組子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用培養(yǎng)基BMMY對重組子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵4 d后的發(fā)酵液離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測蛋白的表達(dá)情況。電轉(zhuǎn)化方法、重組子的篩選和發(fā)酵條件參照Invitrogen 公司的畢赤酵母菌實(shí)驗(yàn)操作手冊。

利用鎳柱親和層析的方法對重組酶進(jìn)行純化并對純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析蛋白純化的效果和重組蛋白分子質(zhì)量。

1.2.4 重組AnabfA的酶活檢測

酶活測定的反應(yīng)體系：25 μL 4 mmol/LpNPAF溶液，50 μL 0.1 mol/L pH 5.5醋酸鈉緩沖液，25 μL酶溶液。反應(yīng)條件：將反應(yīng)體系置于50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后迅速加入100 μL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)?？瞻讓φ眨簩⒚敢涸诜兴≈袦缁?0 min做空白對照。將終止反應(yīng)的反應(yīng)體系靜置15 min后，用酶標(biāo)儀測410 nm下的吸光值，根據(jù)對硝基苯酚制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中對硝基苯酚的含量。酶活的定義：每分鐘產(chǎn)生1 μmol/L的對硝基苯酚所需的酶量為1個(gè)酶單位。以Bradford 測定發(fā)酵液蛋白質(zhì)的濃度[21]，從而測定酶的比活。

1.2.5 重組AnabfA的酶學(xué)性質(zhì)研究

酶的最適溫度及其溫度穩(wěn)定性：在pH 5.5的條件下，用酶標(biāo)儀測定酶在不同溫度(30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)下的酶活，以測得的最高酶活為100%，計(jì)算其他溫度下的相對酶活，將酶在上述各溫度下保溫30 min后，測定殘余酶活。

酶的最適pH及其pH穩(wěn)定性：用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制不同pH(2.4、3、3.4、4、4.4、5、5.4、6、6.4、7、7.4、8)的pNPAF溶液，在50 ℃的條件下測定不同pH條件下的相對酶活，把酶液在上述不同pH條件下處理30 min后，測定其殘余酶活。

金屬離子對重組AnabfA活性的影響：以不加金屬離子的酶液為對照，在終濃度為1 mmol/L的金屬離子(K+、Fe2+、Fe3+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Al3+)的溶液中測定這些金屬離子對酶活性的影響。

重組AnabfA的動(dòng)力學(xué)研究：將純化的酶加入到含有不同底物濃度對硝基苯阿拉伯呋喃糖苷(0.187 5～1.87 5 mmol/L)中，在pH 5.5，溫度50 ℃下反應(yīng)10 min，計(jì)算初始反應(yīng)速度。利用Lineweavere-Burk plot法計(jì)算獲得Km值和Vmax值。

1.2.6 重組AnabfA的糖基化修飾分析

用NetNGlyc 1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server對酶的糖基化水平及其糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。用去糖基化酶PNGase F和O-Glycosidase對重組酶進(jìn)行處理，并對處理前后的酶進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.7 重組AnabfA對麥汁過濾性能的影響及其與木聚糖酶的協(xié)同作用

取50 g經(jīng)EBC粉碎機(jī)粉碎的單二大麥麥芽于糖化杯中，加入200 mL去離子水和31.2 mU/g絕干麥芽重組AnabfA進(jìn)行協(xié)定糖化(圖2)。糖化結(jié)束后，在10～15 min內(nèi)使醪液冷卻至室溫，用去離子水使糖化杯中的內(nèi)容物定重為450 g，將糖化醪攪拌均勻，并用中速濾紙過濾，將最初收集的100 mL濾液返回重濾，收集濾液，即為協(xié)定麥汁。測定麥汁的過濾速度、黏度、濁度、 AX和PAX含量。過濾速度：從最初收集的100 mL濾液返回重濾開始計(jì)時(shí)，30 min內(nèi)過濾出多少體積的麥汁，即為過濾速度。麥汁的濁度采用EBC濁度計(jì)直接讀數(shù)[22]。麥汁的黏度采用落球計(jì)黏度測定法[22]。PAX為麥汁80%的乙醇沉淀物[4]，用Douglas法測定AX和PAX的含量[23]。

圖2 糖化曲線Fig.2 Curve of saccharification

測定重組AnabfA與木聚糖酶同時(shí)作用和連續(xù)作用于底物的協(xié)同能力。反應(yīng)底物：大麥阿拉伯木聚糖，從單二大麥麥芽中提取[4]。反應(yīng)在0.1 mol/L的醋酸鹽緩沖液和50 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)總體系為10 mL，重組AnabfA 0.067 U/mL，木聚糖酶333 U/mL，阿拉伯木聚糖2 mg/mL。對照組：以不加酶只加底物的反應(yīng)體系為空白對照。

同時(shí)作用：重組AnabfA與木聚糖酶同時(shí)作用于底物，反應(yīng)時(shí)間4 h，測定產(chǎn)生還原糖的量。連續(xù)作用：先用一種酶(重組AnabfA或木聚糖酶)作用與底物，反應(yīng)4 h后，在沸水浴中滅活10 min，再加入另一種酶(木聚糖酶或重組AnabfA)反應(yīng)4 h，測定產(chǎn)生還原糖的量。協(xié)同能力：重組α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶與木聚糖酶同時(shí)或連續(xù)作用于底物產(chǎn)生還原糖的量與兩種酶分別單獨(dú)作用于底物產(chǎn)生的還原糖量之和的比值。

保護(hù)綠水青山，古已有之。歷史經(jīng)驗(yàn)告訴我們，人類與自然是密不可分的。保護(hù)自然便是保護(hù)人類自己，“斧斤以時(shí)入山林”的古訓(xùn)，一語千年傳遞尊重自然的聲音?！疤烊撕弦弧?，“道法自然”的哲理，一語中的傳承順應(yīng)自然的聲音。人類只有尊重自然，順應(yīng)自然，才能真正做到保護(hù)自然，保護(hù)自己。我國古人的敦敦教誨，仍以持續(xù)的精神力量，指導(dǎo)我們的生活。

2 結(jié)果與討論

2.1 AnabfA基因的克隆及其在畢赤酵母中的表達(dá)

2.1.1 AnabfA基因的克隆

黑曲霉AnabfA在NCBI上Gene ID為4982505，以黑曲霉的基因組DNA為模版，通過PCR對AnabfA序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到1 790 bp的目的基因。通過比對，目的基因與NCBI上報(bào)道的AnabfA的相似度為100%。

根據(jù)信號肽預(yù)測結(jié)果，AnabfA N端含有18個(gè)氨基酸的信號肽。在NCBI上查找得到AnabfA只有1個(gè)50 bp的內(nèi)含子序列，通過重疊PCR去除AnabfA的信號肽、內(nèi)含子和終止密碼子序列獲得目的基因QAnabfA?；驕y序結(jié)果顯示QAnabfA序列長度為1 683 bp ，信號肽、內(nèi)含子和終止密碼子序列完全去除。

2.1.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-QAnabfA的構(gòu)建及其在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)

將基因片段QAnabfA與表達(dá)載體pPICZαA進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-QAnabfA，NotI 與EcoR I 對pPICZαA-QAnabfA進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切條帶大小符合，表明目的條帶與載體連接正確。重組表達(dá)載體pPICZαA-QAnabfA與空載表達(dá)載體pPICZαA通過電轉(zhuǎn)化的方法分別轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33，并通過篩選得到重組菌株與空載重組子。

利用BMGY和BMMY培養(yǎng)基對重組菌株和空載重組菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵4 d后的培養(yǎng)液的上清液，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果見圖3，泳道3、4比泳道1、2在預(yù)期的位置多出了1條明亮的條帶，說明重組菌株已經(jīng)得到成功的表達(dá)。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker； 1、2-空載重組菌發(fā)酵上清液； 3、4-重組菌發(fā)酵上清液圖3 重組菌株發(fā)酵液SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant strain fermentation supernatants

2.2 重組AnabfA的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.2.1 重組AnabfA的分離純化及其去糖基化分析

用鎳柱親和層析的方法對重組蛋白進(jìn)行純化，將純化后的酶液進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果(圖4)顯示，泳道3只有1條100 kDa左右的蛋白質(zhì)條帶，說明純化效果良好，但蛋白條帶彌散，明顯高于目的蛋白分子質(zhì)量的理論大小70 kDa，這可能是由于畢赤酵母中蛋白質(zhì)的糖基修飾化作用。蛋白質(zhì)糖基化預(yù)測軟件對重組AnabfA的氨基酸序列分析，結(jié)果顯示，重組AnabfA氨基酸條帶上有9個(gè)N糖基化位點(diǎn)和5個(gè)O糖基化位點(diǎn)，用酶PNGase F和O-Glycosidase切除重組AnabfA的糖基化側(cè)鏈，進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖5所示，泳道2中103 kDa和36 kDa處的條帶分別為酶O-Glycosidase和PNGase F的條帶，因此70 kDa處的條帶為目的蛋白條帶，符合理論值大小。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker； 1、2-未純化的酶液；3-純化的酶液圖4 重組AnabfA純化后SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE Analysis of purified recombinant AnabfA

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker； 1-糖基化酶處理后的酶液；2-未經(jīng)糖基化酶處理的酶液圖5 重組AnabfA經(jīng)糖基化酶處理后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE Analysis of recombinant AnabfA after glycosylase treatmen

2.2.2 溫度和pH對重組AnabfA活性的影響

圖6 溫度對重組AnabfA活力及其穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effects of temperature on the activity and stability of recombinant AnabfA

圖7 pH對重組AnabfA活力及其穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effects of pH on the activity and stability of recombinant AnabfA

2.2.3 金屬離子對重組AnabfA活性的影響

Cu2+、Zn2+和Fe2+對重組AnabfA的酶活有抑制作用，相對酶活力只有對照的17%、8%、80%；Fe3+對重組AnabfA的酶活有促進(jìn)作用，相對酶活為對照的131%； Ni2+、K+、Al3+、Co2+、Mn2 +和Mg2+對其酶活幾乎沒有影響(圖8)。

2.2.4 重組AnabfA的動(dòng)力學(xué)

圖8 金屬離子對重組AnabfA酶活的影響Fig.8 Effects of metal ions on the activity of recombinant AnabfA

根據(jù)AnabfA在不同濃度pNPAF(0.187 5～1.875 mmol/L)下，計(jì)算得到初始反應(yīng)速度。利用Lineweavere-Burk plot法計(jì)算獲得酶促反應(yīng)參數(shù)Km值和Vmax值分別為0.78 mmol/L和2.57 μmol/(min·mg)。

2.3 重組AnabfA在麥汁制造中的應(yīng)用研究

2.3.1 重組AnabfA對麥汁過濾性能的影響

在大麥麥芽糖化的初始階段添加重組AnabfA，測定糖化結(jié)束后獲得的麥汁的相關(guān)指標(biāo)，結(jié)果見表2。麥汁的過濾速度提高了12.8%，黏度降低了2.4%，濁度提高了2.3%。麥汁中AX的含量增加，PAX的含量減少，表明重組AnabfA可以使水不溶性的阿拉伯木聚糖部分溶解，同時(shí)也促進(jìn)了麥汁中PAX的降解。PAX的降解可以降低麥汁的黏度，提高麥汁的過濾速度。

表2 重組AnabfA對麥汁過濾性能的影響Table 2 Effect of recombinant AnabfA on the filterability of wort

2.3.2 重組AnabfA與木聚糖酶的協(xié)同作用

將木聚糖酶和重組AnabfA按不同的組合方式作用于大麥麥芽木聚糖，反應(yīng)結(jié)束后測定產(chǎn)生還原糖的量，結(jié)果見表3，當(dāng)重組AnabfA和木聚糖酶同時(shí)作用于木聚糖時(shí)，協(xié)同能力為113%；當(dāng)先加AnabfA再加木聚糖酶作用于木聚糖時(shí)，協(xié)同能力為122%，當(dāng)先加木聚糖酶再加AnabfA作用于木聚糖時(shí)，協(xié)同能力124%。這說明當(dāng)以大麥麥芽木聚糖為底物時(shí)，AnabfA和木聚糖酶具有良好的協(xié)同作用，并且這兩種酶對木聚糖的降解是相互促進(jìn)的。進(jìn)一步證明在麥芽糖化的過程中，重組AnabfA可以與麥芽本身的木聚糖酶通過協(xié)同作用促進(jìn)麥汁中PAX的降解。

表3 重組AnabfA和木聚糖酶降解大麥麥芽木聚糖的協(xié)同作用Table 3 Synergistic action of endoxylanase andrecombinant AnabfA on and barley malt arabinoxylan

3 結(jié)論

對黑曲霉的AnabfA進(jìn)行克隆并在畢赤酵母中進(jìn)行高效表達(dá)，重組AnabfA用鎳柱進(jìn)行分離純化，分子質(zhì)量為70 kDa，最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為50 ℃和5.5；在55 ℃以下，pH3.5～5.5 穩(wěn)定性較好。Cu2+、Zn2+和Fe2+對重組AnabfA的酶活有抑制作用，F(xiàn)e3+對重組AnabfA的酶活有促進(jìn)作用，酶促反應(yīng)參數(shù)Km值和Vmax值分別為0.78 mmol/L和2.57 μmol/(min·mg)。重組AnabfA和木聚糖酶對大麥麥芽阿拉伯木聚糖的降解有較好的協(xié)同作用，可以降低麥汁中PAX的含量，從而降低了麥汁的黏度，提高了麥汁的過濾速度。在大麥麥芽協(xié)定糖化的初始階段添加重組AnabfA，添加量為31.2 mU/g，麥汁的黏度降低了2.3%，麥汁的過濾速度提高了12.8%，該結(jié)果為AnabfA的工業(yè)應(yīng)用提供了重要的理論參考。

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