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    馬克斯克魯維酵母生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇工藝優(yōu)化及耐高溫特性分析

    2018-03-16 08:17:02牛明福李亞恒陳金帥李陽
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年2期
    關(guān)鍵詞:苯丙氨酸氮源碳源

    牛明福,李亞恒,陳金帥,李陽

    1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 洛陽,471023) 2(洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽,471023) 3(河南科技大學(xué),微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室,河南 洛陽,471023)

    2-苯乙醇(2-phenylethanol,2-PE)又稱β-苯乙醇,是一種具有柔和而持久玫瑰香氣的芳香醇,廣泛應(yīng)用于日化和食用香精中[1-2]。目前主要采用化學(xué)合成或從天然物中提取獲得該成分?;瘜W(xué)合成2-苯乙醇雖已步入工業(yè)化生產(chǎn)階段,但其產(chǎn)物中存在諸多復(fù)雜且難以除去的副產(chǎn)物,如氯乙醇、鄰氯乙苯、聯(lián)苯等副產(chǎn)物,并伴隨刺激性氣味,嚴(yán)重危害人體健康。許多芳香植物如玫瑰、茉莉、風(fēng)信子等的精油中含有2-苯乙醇,但含量極低,從中提取的2-苯乙醇不僅價格昂貴,且難以滿足市場需求[3-4]。因此,通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然2-苯乙醇得到了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注[5]。

    多種酵母具有合成2-苯乙醇的能力,如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、畢赤酵母(Pichiasp.)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)及異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)等[6],主要通過艾氏途徑(Ehrlich pathway),將L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成2-苯乙醇[7-8]。限制酵母轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力的因素有兩方面:一方面是發(fā)酵過程中存在嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制效應(yīng),這是影響2-苯乙醇產(chǎn)量的主要瓶頸之一[9];另一方面,為了控制因發(fā)酵產(chǎn)熱造成的溫度上升,需要安裝控溫裝置,導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加[10]。因此,篩選2-苯乙醇耐受性能較好且具有耐高溫能力的優(yōu)質(zhì)菌株是實現(xiàn)生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。在前期研究中,本課題組篩選出1株耐高溫且2-苯乙醇耐受性良好的馬克斯克魯維酵母LY1菌株,其最適生長溫度為37 ℃,在基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中發(fā)酵2-苯乙醇的產(chǎn)量為0.96 g/L。馬克斯克魯維酵母是一種具有可利用底物廣泛、生長速率較快等優(yōu)勢的耐高溫酵母[11]。本試驗通過單因素與響應(yīng)面分析,探討主要培養(yǎng)基成分對酵母合成2-苯乙醇的影響,得到較優(yōu)的培養(yǎng)基組成,并研究LY1菌株在高溫條件下的發(fā)酵性能。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    馬克斯克魯維酵母LY1菌株、釀酒酵母AC菌株:由河南科技大學(xué)微生物基因工程研究室分離鑒定。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    固體YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20.0,蛋白胨 20.0,酵母浸粉 10.0,瓊脂粉 20.0,自然pH值。

    液體種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 20.0,蛋白胨 20.0,酵母浸粉 10.0,自然pH值。

    基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 60.0,蛋白胨 6.0,MgSO40.5,KH2PO45.0,L-苯丙氨酸 6.0,自然pH值。

    1.1.3 主要試劑

    L-苯丙氨酸:生工生物公司(上海)股份有限公司,純度98.5%;2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品:生工生物公司(上海)股份有限公司,純度98.0%;甲醇:西隴化工股份有限公司,色譜純。

    1.2 主要設(shè)備

    恒溫組合式搖床(HYL-C2),太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司;高效液相色譜儀(1260 Infiity),美國安捷倫科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 種子液的制備

    將保種管中的酵母菌劃線接入固體YPD培養(yǎng)基,于28 ℃培養(yǎng)48 h。從培養(yǎng)皿挑取1環(huán)單菌落至5 mL種子培養(yǎng)基中,于28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。

    1.3.2 2-苯乙醇的轉(zhuǎn)化合成

    將種子液按10%接種量接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基,28 ℃條件下200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。

    1.3.3 2-苯乙醇的檢驗方法

    采用反相高效液相色譜法測定2-苯乙醇的產(chǎn)量[12],轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48 h后,發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心10 min,小心吸取上清,用0.22 μm有機系濾膜過濾。HPLC檢測條件為:Venusil MP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm),進(jìn)樣量10 μL,流動相為(甲醇)∶(水)=6∶4,流速0.6 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長260 nm,檢測時間12 min。

    1.3.4 單因素試驗

    以2-苯乙醇產(chǎn)量為指標(biāo),分別考察轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基主要成分對2-苯乙醇合成的影響,包括L-苯丙氨酸添加量、碳源種類及添加量、氮源種類及添加量[13]。各項添加水平如下:

    L-苯丙氨酸:0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L;

    不同種類碳源:葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、菊粉、乳糖、甘油均為60.0 g/L;

    碳源:20.0、40.0、60.0、80.0、100.0、120.0 g/L;

    不同種類氮源:酵母浸粉、蛋白胨、尿素、硫酸銨均為6.0 g/L;

    氮源:0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 g/L。

    1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,選取3個自變量,以2-苯乙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值,采用Box-Behnken設(shè)計方法對培養(yǎng)基成分進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗,利用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和回歸分析[14]。

    1.3.6 耐受性試驗

    用無菌水將種子液稀釋,吸取200 μL均勻涂布于含不同質(zhì)量濃度2-苯乙醇(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L)的固體培養(yǎng)基上,分別置于28、36、42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,計算長出的酵母菌落數(shù)。

    1.3.7 高溫發(fā)酵試驗

    將種子液接種到優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,分別在28、30、32、34、36、38、40、42 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵,測定發(fā)酵液中2-苯乙醇的質(zhì)量濃度。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗結(jié)果

    2.1.1L-苯丙氨酸添加量對2-苯乙醇合成的影響

    艾氏途徑中,L-苯丙氨酸作為底物參與2-苯乙醇的合成。L-苯丙氨酸添加量對2-苯乙醇合成的影響如圖1所示,當(dāng)L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度范圍在0~6 g/L時,2-苯乙醇產(chǎn)量增加幅度較大,L-苯丙氨酸添加量超過8.0 g/L時,2-苯乙醇產(chǎn)量基本穩(wěn)定,但底物質(zhì)量濃度的增加會使轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢[15],造成原料利用率降低。因此,L-苯丙氨酸最佳添加量應(yīng)為8 g/L。

    圖1 L-苯丙氨酸添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.1 Effects of L-Phe dosage on 2-PE production

    2.1.2 碳源種類對2-苯乙醇合成的影響

    馬克斯克魯維酵母可以產(chǎn)生菊粉酶、乳糖酶等水解酶,與其他酵母相比可利用的底物較廣泛[16]。碳源種類對2-苯乙醇合成的影響如圖2所示,LY1菌株能夠較好地利用葡萄糖和蔗糖作為碳源,以供生物轉(zhuǎn)化2-苯乙醇,亦能利用菊粉,但以麥芽糖、乳糖、甘油作為碳源的2-苯乙醇產(chǎn)量較低。因此,選擇產(chǎn)量最高且成本較低的蔗糖作為碳源進(jìn)行后續(xù)試驗。

    圖2 不同碳源對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.2 Effects of carbon sources on 2-PE production

    2.1.3 碳源添加量對2-苯乙醇合成的影響

    以蔗糖作為碳源,考察不同添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響,結(jié)果見圖3。蔗糖質(zhì)量濃度在20.0~40.0 g/L范圍內(nèi)時,隨著蔗糖添加量的增加,2-苯乙醇產(chǎn)量顯著提高。但隨著蔗糖的繼續(xù)添加,2-苯乙醇產(chǎn)量呈下降趨勢,說明在高糖環(huán)境下,酵母細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的差異影響了菌體的正常生長,導(dǎo)致2-苯乙醇產(chǎn)量下降。因此,確定蔗糖的最佳添加量是40.0 g/L。

    圖3 蔗糖添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.3 Effect of sucrose dosage on 2-PE production

    2.1.4 氮源種類對2-苯乙醇合成的影響

    氮源分為有機氮和無機氮,選擇酵母浸粉、蛋白胨、尿素、(NH4)2SO44種常用氮源[17],分別考察添加不同氮源和不添加氮源(僅以L-苯丙氨酸作為唯一氮源)對LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 不同氮源對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.4 Effects of nitrogen sources on 2-PE production

    酵母浸粉或蛋白胨作為氮源以供酵母利用時,轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的效果高于尿素和(NH4)2SO4,說明LY1菌株利用有機氮的能力高于無機氮。當(dāng)L-苯丙氨酸作為唯一氮源時,2-苯乙醇轉(zhuǎn)化效果并不理想,是因為L-苯丙氨酸作為氮源不能滿足酵母正常生長需求,導(dǎo)致菌體活性不高,轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力也隨之下降。因此,選擇酵母浸粉作為轉(zhuǎn)化氮源以供后續(xù)試驗。

    2.1.5 氮源添加量對2-苯乙醇合成的影響

    以酵母浸粉為氮源,考察氮源添加量對2-苯乙醇合成的影響,結(jié)果見圖5。隨著酵母浸粉添加量的增加,2-苯乙醇產(chǎn)量呈上升趨勢,當(dāng)酵母浸粉質(zhì)量濃度超過6.0 g/L時,2-苯乙醇產(chǎn)量略有下降。說明添加適量的氮源有利于2-苯乙醇的合成,氮源過量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的效果并不明顯。當(dāng)培養(yǎng)基中酵母浸粉質(zhì)量濃度超過10.0 g/L時,高效液相色譜的結(jié)果會受到酵母浸粉的影響,無法檢測2-苯乙醇產(chǎn)量。因此,確定酵母浸粉的最佳添加量是6.0 g/L。

    圖5 酵母浸粉添加量對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.5 Effect of yeast extracts dosage on 2-PE production

    2.2 響應(yīng)面分析試驗結(jié)果

    綜合單因素試驗結(jié)果,選取L-苯丙氨酸添加量(A)、蔗糖添加量(B)、酵母浸粉添加量(C)作為3個自變量,以2-苯乙醇產(chǎn)量作為響應(yīng)值,設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗,考察3種培養(yǎng)基成分與2-苯乙醇合成之間的關(guān)系。試驗設(shè)計方案與結(jié)果見表1。

    對表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸擬合,得到如下回歸方程:Y=1.44+3.125E-003A+0.018B+0.054C+2.000E-003AB-7.500E-004AC-2.500E-003BC-8.125E-003A2-0.054B2-0.079C2,其響應(yīng)值與自變量之間呈線性關(guān)系且較為顯著(P>F=0.000 1,線性相關(guān)系數(shù)R2=0.989 6),該方程可用于分析和預(yù)測2-苯乙醇的產(chǎn)量。

    根據(jù)回歸方程得到最優(yōu)培養(yǎng)基組成為:L-苯丙氨酸8.39 g/L,蔗糖43.25 g/L,酵母浸粉6.68 g/L,預(yù)測2-苯乙醇的產(chǎn)量為1.448 g/L。為證實預(yù)測結(jié)果,用以上配方重復(fù)試驗3次,得2-苯乙醇平均產(chǎn)量為1.450 g/L,實驗值與預(yù)測值擬合性良好。

    表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及響應(yīng)值Table 1 Experimental design and correspondingresponse value

    2.3 因素間的交互影響

    對響應(yīng)面試驗進(jìn)行方差分析,回歸方程的交互項中只有BC項顯著(p=0.047 3),其余交互項均不顯著。說明蔗糖與酵母浸粉添加量對2-苯乙醇合成的影響顯著,而L-苯丙氨酸添加量對其影響不顯著。響應(yīng)面回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖形,如圖6。

    圖6 蔗糖與酵母浸粉影響2-苯乙醇產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface and contour of the effect on 2-PE production by saccharose and yeast extracts

    圖6-a是以蔗糖與酵母浸粉添加量為變量生成的響應(yīng)面圖,兩者添加量的增加均會使2-苯乙醇產(chǎn)量增大,過量的蔗糖與酵母浸粉不利于2-苯乙醇的生物合成。圖6-b中等高線的形狀可以反映交互效應(yīng)的強弱,等高線圖成橢圓形,說明兩因素之間交互作用顯著,對2-苯乙醇合成的影響較大。

    2.4 耐受性試驗結(jié)果

    一般酵母菌的最適生長溫度在28 ℃左右,而馬克斯克魯維酵母是一種耐高溫酵母,可以在42 ℃的高溫條件下進(jìn)行發(fā)酵。將酵母菌涂布于含有不同質(zhì)量濃度2-苯乙醇的固體培養(yǎng)基中,在28~42 ℃培養(yǎng),考察高溫對酵母細(xì)胞耐受2-苯乙醇的影響,結(jié)果如表2所示。

    表2 不同溫度下2-苯乙醇耐受性結(jié)果Table 2 The tolerance of 2-PE under different temperatures

    注:+表示生長狀況;-表示征耐受極限;×表示完全不生長。

    當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時,馬克斯克魯維酵母LY1菌株和釀酒酵母AC菌株的最高2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度均為2.5 g/L。2-苯乙醇添加量過高會抑制酵母的生長繁殖[18],隨著培養(yǎng)溫度升高和2-苯乙醇質(zhì)量濃度的增加,酵母菌落數(shù)不斷減少表明:高溫和2-苯乙醇的聯(lián)合脅迫作用導(dǎo)致LY1菌株的2-苯乙醇耐受能力降低,37 ℃時的耐受質(zhì)量濃度為2.0 g/L,且42 ℃時的耐受質(zhì)量濃度仍為1.5 g/L。然而,釀酒酵母AC菌株的耐受能力較差,42 ℃時僅高溫脅迫已完全抑制其正常生長,在37 ℃時雖能正常生長但2-苯乙醇耐受質(zhì)量濃度幾乎為0 g/L。說明馬克斯克魯維酵母具有較強的高溫和2-苯乙醇耐受能力,且具有很大的高溫發(fā)酵2-苯乙醇的潛力。

    2.5 高溫發(fā)酵試驗結(jié)果

    將種子液接種到上述優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,在28~42 ℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵,考察高溫對LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響,確定最適發(fā)酵溫度,結(jié)果如圖7所示。發(fā)酵溫度在28~32 ℃范圍內(nèi)時,2-苯乙醇產(chǎn)量較高且穩(wěn)定,說明LY1菌株轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的最佳溫度范圍在28~32 ℃。隨著溫度的繼續(xù)上升,2-苯乙醇產(chǎn)量逐漸下降,在42 ℃時,2-苯乙醇產(chǎn)量為0.809 g/L,說明LY1菌株高溫發(fā)酵能力較強,在42 ℃高溫環(huán)境下仍具有一定轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力。

    圖7 發(fā)酵溫度對轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on 2-PE production

    目前,國內(nèi)外有關(guān)溫度對酵母轉(zhuǎn)化2-苯乙醇影響的報道較少。黃筱萍等[15]研究了不同轉(zhuǎn)化溫度對釀酒酵母SH003合成2-苯乙醇的影響,其最適轉(zhuǎn)化溫度為28~30 ℃,低于26 ℃和高于32 ℃產(chǎn)物濃度明顯下降。明紅梅等[19]研究了溫度對傳統(tǒng)濃香型大曲中分離篩選的異常威克漢姆酵母菌株J7發(fā)酵生產(chǎn)2-苯乙醇的影響,發(fā)現(xiàn)在33 ℃下發(fā)酵時,2-苯乙醇產(chǎn)量最高,并采用響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時,2-苯乙醇產(chǎn)量為63.50 mg/kg。通常酵母菌轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的發(fā)酵溫度為28~30 ℃,而耐高溫酵母可以在35 ℃以上合成2-苯乙醇。ETSCHMANN等[20]篩選出的耐熱性馬克斯克魯維酵母CBS600菌株在35 ℃條件下,在以糖蜜為碳源的合成培養(yǎng)基中發(fā)酵41 h后,2-苯乙醇終產(chǎn)量達(dá)到0.89 g/L。ESHKOL等[21]從耐熱釀酒酵母菌株Ye9系列中篩選到了1株能夠耐受2.5 g/L以上2-苯乙醇的Ye9-612,30 ℃發(fā)酵72 h后,產(chǎn)量達(dá)到0.85 g/L。LY1菌株與其他耐高溫菌株相比,在35 ℃以上高溫條件下具有更強的2-苯乙醇發(fā)酵能力。LY1菌株的最適生長溫度為37 ℃,而其2-苯乙醇的最適轉(zhuǎn)化溫度低于最適生長溫度可能與2-苯乙醇合成的相關(guān)酶的活性及穩(wěn)定性有關(guān)[19]。對比耐受性試驗結(jié)果,LY1菌株在36 ℃時的2-苯乙醇產(chǎn)量遠(yuǎn)低于耐受極限,其高溫發(fā)酵2-苯乙醇的產(chǎn)量仍具有較大的提升空間。

    3 結(jié)論

    微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇具有成本低、產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點,已受到廣泛關(guān)注。如何提高微生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的產(chǎn)量是近年來的研究重點之一。發(fā)酵培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件能很大程度上影響酵母細(xì)胞生產(chǎn)2-苯乙醇的產(chǎn)量。本研究通過單因素試驗篩選出合適的轉(zhuǎn)化碳源和氮源,并對主要培養(yǎng)基成分的添加量進(jìn)行響應(yīng)面分析,優(yōu)化后的結(jié)果為:L-苯丙氨酸8.39 g/L,蔗糖43.25 g/L,酵母浸粉6.68 g/L。在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h后,2-苯乙醇產(chǎn)量可達(dá)到1.450 g/L,較優(yōu)化前提高了51.0 %。與其他耐高溫菌株相比,LY1菌株在35 ℃以上具有更強的2-苯乙醇發(fā)酵能力,且在42 ℃高溫條件下仍具有一定的2-苯乙醇耐受和發(fā)酵能力,后續(xù)研究可從基因改造方向入手[22],提高其高溫和2-苯乙醇耐受性能,進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化2-苯乙醇的能力。

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