長期氯化錳腹腔注射母鼠的子代雄鼠生精細(xì)胞凋亡變化及其機制探討

王乾興，于明明，李姣，路健，湯賢春，張先平

(1遵義醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州遵義，563003；2 婁底市中心醫(yī)院)

由于環(huán)境污染、不良生活習(xí)慣等的影響，男性精子數(shù)、精子活動率、正常精子率等均顯著下降，已引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注[1，2]。環(huán)境錳暴露是雄性生殖障礙的一個重要原因素。錳可通過血睪屏障而蓄積于睪丸，引起男性精液質(zhì)量下降和雞、大鼠生精細(xì)胞凋亡等[3～5]。但上述關(guān)于動物實驗的研究大多為急性或亞急性錳染毒對親代雄性的影響，而慢性染毒對子代的生殖毒理效應(yīng)尚未見報道。錳的毒性機制之一是上調(diào)體內(nèi)活性氧簇(ROS)水平，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)，過度ERS會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6～8]。ERS是否與錳的雄性生殖毒性有關(guān)還不清楚。以往關(guān)于錳的毒性機制研究所采用的染毒劑量大都在7.5 mg/kg體質(zhì)量以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于環(huán)境或特定場所的錳暴露水平。本研究中在母代大鼠腹腔長期注射氯化錳，觀察子代雄性大鼠睪丸組織中生精細(xì)胞凋亡情況，明確母代長期氯化錳腹腔注射對子代雄性大鼠生精細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步觀察了子代雄鼠睪丸組織ROS水平及ERS介導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探討ERS介導(dǎo)的凋亡途徑在錳引起的生殖毒性中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 滿月SPF級雌性SD大鼠32只，體質(zhì)量90～120 g，購于第三軍醫(yī)大醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。每天采光12 h，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～22 ℃，自由進(jìn)食飲水。

MnCl2·4H2O(分析純 )購于中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于美國Roche公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、含半胱胺酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase 3)、含半胱胺酶的天冬氨酸蛋白水解酶12(Caspase 2)兔多抗購于英國Abcam公司；GAPDH鼠單抗購于美國Proteintech公司；ROS檢測試劑盒(化學(xué)熒光法)購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物分組、染毒及取材 將大鼠隨機分為觀察1、2、3組和對照組，各8只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分別腹腔注射2、4、8 mg/kg的MnCl2和等容生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射5 d后休息2 d，共8周。然后與性成熟雄性SD大鼠按1∶3合籠交配，見陰栓者視為妊娠，雌雄分籠飼養(yǎng)。雌鼠在妊娠期和哺乳期繼續(xù)染毒，總?cè)径緯r間共14周。從各組雌鼠的12周齡雄性子鼠中隨機選取8只斷頭處死，立即分離雙側(cè)睪丸。

1.3 生精細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)測算 子鼠睪丸冠狀面石蠟切片(4 μm)常規(guī)脫蠟、水化。微波修復(fù)抗原。0.3% H2O2-甲醇溶液封閉10 min，PBS沖洗。滴加50 μL TUNEL反應(yīng)液，37℃濕盒避光溫育1 h。PBS沖洗3次×5 min。加轉(zhuǎn)化劑37 ℃反應(yīng)30 min，PBS沖洗，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。同時設(shè)陰性對照(只加標(biāo)記反應(yīng)液)和陽性對照(10 μg /mL的DNAase I預(yù)處理) 。每張切片隨機選擇10個生精小管，計算凋亡信號陽性的生精細(xì)胞數(shù)占總生精細(xì)胞數(shù)的比例，即為生精細(xì)胞AI。

1.4 睪丸組織ROS水平檢測 準(zhǔn)確稱取少量睪丸組織, 剪碎，加入生理鹽水，超聲粉碎制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液用化學(xué)熒光法檢測ROS水平，按試劑盒說明書操作，結(jié)果以熒光強度表示。

1.5 睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白表達(dá)檢測 取子代雄鼠睪丸組織100 mg加入500 μL RIPA 裂解液，同時加入5 μL蛋白酶抑制劑，4 ℃電動勻漿。 4 ℃環(huán)境下12 000g離心15 min，小心吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白變性后上樣，10%分離膠120 V恒壓電泳，100 mA恒流轉(zhuǎn)印，5% 脫脂奶粉封閉1h，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光、顯影、定影。將膠片掃描，用Image Pro Plus 軟件計算各條帶灰度值。以GAPDH為內(nèi)參照，各目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

2.1 各組雄性子鼠睪丸組織生精細(xì)胞AI比較 觀察1、2、3組和對照組AI分別為9.05%±1.02%、15.87%±1.31%、19.59%±1.12%、5.72%±0.53%，各組生精細(xì)胞AI相比，P均<0.05。

2.2 各組雄性子鼠睪丸組織ROS水平比較 觀察1、2、3組和對照組雄性子鼠睪丸組織ROS水平(以熒光強度表示)分別為335.67±41.12、452.75±37.55、547.25±41.11、210.32±37.58，各組睪丸組織ROS水平相比，P均<0.05。

2.3 各組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白比較 各組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白相對表達(dá)量見表1。觀察1、2、3組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)，觀察2、3組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白相對表達(dá)量均高于低劑量組(P均<0.05)，觀察3組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白相對表達(dá)量均高于觀察2組(P均<0.05)。

表1 各組雄性子鼠睪丸組織GRP78、CHOP、Caspase12、Caspase3蛋白相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較,*P<0.05；與觀察1組比較，#P<0.05；與觀察2組比較，△P<0.05。

3 討論

關(guān)于錳對子代生殖生殖毒性的影響尚未見報道。而且以往關(guān)于錳的毒性機制研究所采用的染毒劑量大都在7.5 mg/kg體質(zhì)量以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于環(huán)境或特定場所的錳暴露水平，對錳毒性的職業(yè)防護(hù)的指導(dǎo)意義有限[9～11]。本研究用較低劑量氯化錳染毒，結(jié)果顯示，隨著錳染毒劑量的增加，雄性子鼠睪丸組織生精細(xì)胞AI增高，表明長期低劑量錳染毒可導(dǎo)致生精能力減弱[12]。

錳的毒性機制之一是提高機體的ROS水平。ROS是需氧細(xì)胞進(jìn)行正常生化反應(yīng)的產(chǎn)物，主要包括O2-、H2O2及HO2·、·OH等，可參與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。ROS分子具有孤對電子，因而具有高氧化性。當(dāng)機體內(nèi)ROS過量產(chǎn)生時，可啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而損傷膜功能及其完整性，從而造成氧化應(yīng)激損傷，啟動細(xì)胞凋亡程序[6，13,14]。本研究結(jié)果顯示，長期低劑量錳染毒后，子代大鼠睪丸組織內(nèi)ROS水平隨錳劑量升高而逐漸升高。提示錳的蓄積可能作用于線粒體，增加子代大鼠睪丸組織ROS水平，提高其氧化應(yīng)激狀態(tài)。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)折疊、維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的最重要的一個細(xì)胞器。作為一個膜性細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對應(yīng)激刺激極為敏感。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激時，ROS可直接攻擊與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)酶的活性中心巰基而使其失活，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累，產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。URP是ERS早期反應(yīng)，其作用是減少蛋白質(zhì)生物合成，同時加強蛋白質(zhì)降解，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷，從而維持細(xì)胞的生存。當(dāng)ERS進(jìn)一步加劇時則抑制UPR，轉(zhuǎn)而誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。GRP78是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的ERS標(biāo)志性分子伴侶，其表達(dá)量的高低反映ERS反應(yīng)強度；C/EBP同源蛋白(CHOP)是ERS特異性的轉(zhuǎn)錄因子，ERS誘導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終都傳導(dǎo)到CHOP，CHOP的表達(dá)可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異的凋亡蛋白Caspase12的表達(dá)，從而激活凋亡的最終執(zhí)行者Caspase3表達(dá)，從而引起細(xì)胞凋亡[16,17]。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，各錳染毒組GRP78、CHOP、Caspase12和Caspase3表達(dá)均升高，且隨錳染毒劑量的增加而增加。提示氯化錳染毒可導(dǎo)致子代大鼠睪丸組織細(xì)胞發(fā)生ERS。隨著錳染毒劑量的增加，ERS逐漸加重，啟動了睪丸組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase12信號通路，最終激活Caspase3而引起細(xì)胞凋亡[18,19]。

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