缺氧微環(huán)境中HIF-1α基因沉默的人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3侵襲和遷移能力觀察

張展，李鵬云，閆歡，王艷，余潔

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

子癇前期是妊娠期特有高血壓疾病，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的主要原因之一，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究[1]認(rèn)為，胎盤發(fā)育過(guò)程中滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力減弱導(dǎo)致的子宮螺旋動(dòng)脈重塑不足是子癇前期的主要誘發(fā)因素之一。妊娠早期滋養(yǎng)層細(xì)胞處于相對(duì)缺氧環(huán)境中，而缺氧狀態(tài)的主要調(diào)控因子是缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)[2]。HIF-1α參與了滋養(yǎng)細(xì)胞氧依賴相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在子癇前期的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[3]。趨化因子受體4(CXCR4)是趨化因子家族中的重要成員，與乳腺癌、結(jié)直腸癌及卵巢癌等的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4～6]。人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3的生物學(xué)特性與滋養(yǎng)細(xì)胞相似，目前臨床常用其研究體外滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲機(jī)制調(diào)控。2016年9月～2017年8月，我們模擬體外缺氧微環(huán)境，觀察HIF-1α沉默的JEG-3細(xì)胞侵襲、遷移能力的變化，并探討其可能機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人絨毛膜癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司， HIF-1α 小干擾RNA(HIF-1α siRNA)購(gòu)自廣州銳博公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA KIT、熒光定量試劑盒SYBR 購(gòu)自日本Toyobo公司，引物合成由上海生工公司完成，Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Costar公司，基底膜基質(zhì)凝膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Leagene公司，預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，兔抗人HIF-1α單克隆抗體和兔抗人CXCR4單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。主要儀器包括美國(guó) Thermo 公司CO2恒溫培養(yǎng)箱，中國(guó)上海力康公司B2 型生物安全柜，美國(guó)ABI公司熒光定量PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司高速臺(tái)式低溫離心機(jī)，美國(guó)Alpha Inotech公司凝膠成像儀。

1.2 JEG-3細(xì)胞培養(yǎng)及體外缺氧微環(huán)境模擬 將JEG-3細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基在(37 ℃、5% CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)瓶約70%時(shí)胰酶進(jìn)行消化傳代。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[7]，以終濃度150 μmol/L的CoCl2來(lái)模擬JEG-3細(xì)胞體外缺氧微環(huán)境。

1.3 細(xì)胞分組及HIF-1α siRNA轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期JEG-3細(xì)胞，分為A、B、C、D組，A、B、C組以終濃度150 μmol/L的CoCl2來(lái)模擬JEG-3細(xì)胞體外缺氧微環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞融合到60%～70%,A、C組分別用HIF-1α siRNA和無(wú)關(guān)序列轉(zhuǎn)染，B、D組不做處理。轉(zhuǎn)染4 h后更換為含血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，除D組外其余三組換成含CoCl2的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，備用。

1.4 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。 Transwell小室鋪膠，細(xì)胞按各組處理后常規(guī)消化用無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，每個(gè)小室加200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)5×104個(gè))，下室加入750 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基；37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，棉簽擦除上室的細(xì)胞和基質(zhì)膠，PBS洗2遍；4%多聚甲醛固定20 min，蘇木素染色10 min后拍照，高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均值，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 各組細(xì)胞遷移能力觀察 采用劃痕試驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后再培養(yǎng)48 h，用200 μL高壓滅菌的槍頭對(duì)各組細(xì)胞劃平行直線，PBS輕柔洗2遍，加入2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基并在顯微鏡下拍照記錄0 h劃痕區(qū)域，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后拍攝此時(shí)的劃痕區(qū)域。使用Image J軟件分析細(xì)胞間的相對(duì)遷移距離，劃痕愈合率=(0 h 劃痕寬度-48 h 劃痕寬度) / 0 h 劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 各組細(xì)胞HIF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè) ①HIF-1α和CXCR4 mRNA檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法。用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外吸收法測(cè)定RNA的濃度和純度 (均在1.8～2.0范圍內(nèi))。cDNA逆轉(zhuǎn)錄按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物序列分別為：HIF-1α 上游引物5′-TGGACACTGGTGGCTCACTA -3′，下游引物5′-ATGCTACTGCAATGCAATGG- 3′；CXCR4 上游引物5′-ACTACACCGAGGAAATGGGCT-3′，下游引物5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA- 3′； β-actin 上游引物5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG- 3′，上游引物5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG- 3′。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s、72 ℃延伸45 s共40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCT表示HIF-1α及CXCR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。②HIF-1α和CXCR4 蛋白檢測(cè)：采用蛋白印跡法。收集細(xì)胞，加入100 μL蛋白裂解液(含1∶100的蛋白酶抑制劑)，BCA法定量測(cè)定蛋白濃度。配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，HIF-1α、CXCR4用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，而后加入一抗(兔抗人HIF-1α抗體、兔抗人CXCR4抗體)于4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗3×10 min，二抗(HRP標(biāo)記的抗兔IgG抗體)室溫孵育1 h，TBST洗3×10 min后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色。用Image J軟件分析條帶的灰度值。以目的蛋白的灰度值表示HIF-1α和CXCR4 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞HIF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)的比較 A組細(xì)胞HIF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯低于B、C、D組(P均<0.05)；B、C組細(xì)胞HIF-1α蛋白、CXCR4 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯高于D組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞HIF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較

注：與其他3組相比，*P<0.05；與D組相比，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 培養(yǎng)48 h后A、B、C、D組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為34.93±8.01、88.40±5.81、82.67±4.28、46.53±4.70，A組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯低于其余3組(P均<0.05)，而B(niǎo)、C組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于D組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 劃痕48 h后各組細(xì)胞劃痕愈合率分別為25.08%±4.73%、74.63%±4.90%、70.22%±3.05%、43.89%±4.05%，A組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(P均<0.05)，B、C組細(xì)胞遷移能力高于D組(P均<0.05)。

3 討論

子癇前期是妊娠20周后以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床癥狀的妊娠期特有疾病，其全球發(fā)病率約2%～8%，可引起多種妊娠并發(fā)癥。子癇前期的發(fā)病機(jī)制眾多，目前公認(rèn)的病因?yàn)樽甜B(yǎng)細(xì)胞侵襲能力不足引起子宮螺旋動(dòng)脈重鑄失敗，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤血流灌注減少、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和胎盤缺氧[1]。缺氧/HIF信號(hào)上調(diào)是子癇前期患者胎盤的一個(gè)典型特征，在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。滋養(yǎng)細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移是胎盤發(fā)育的關(guān)鍵，而缺氧在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中發(fā)揮重要作用[8]。HIF-1α是低氧信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)因子，參與了許多與血管生成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲等方面的氧依賴基因的轉(zhuǎn)錄[3]。研究表明，HIF-1α和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β3(TGF-β3)在妊娠早期的表達(dá)同步，即妊娠5～8周時(shí)氧含量小于20 mmHg兩者表達(dá)升高，妊娠10～12周氧含量開(kāi)始上升達(dá)到60 mmHg兩者表達(dá)開(kāi)始下降，而缺氧條件下抑制HIF-1α表達(dá)后，TGF-β3的表達(dá)顯著下降。因此推測(cè)缺氧通過(guò)HIF-1α下調(diào)TGF-β3表達(dá)進(jìn)而增加早期滋養(yǎng)細(xì)胞向侵襲性表型的分化，促進(jìn)子宮螺旋動(dòng)脈重鑄[9]。JEG-3細(xì)胞是人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而來(lái)，可表達(dá)胎盤分泌的主要激素，如人絨毛膜促性腺激素(hCG)、胎盤催乳素和孕酮[8]。許多學(xué)者推薦該細(xì)胞系進(jìn)行體外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的研究。本研究結(jié)果顯示，JEG-3細(xì)胞中HIF-1α mRNA在缺氧條件下的表達(dá)與常氧條件下并無(wú)明顯改變，但HIF-1α蛋白表達(dá)顯著增加。研究顯示[10]，在常氧條件下HIF-1α被特定的脯氨酰羥化酶(PHD)羥基化后極易被蛋白酶體降解，而在缺氧條件下PHD活性受到抑制，HIF-1α與細(xì)胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1β結(jié)合形成有活性的二聚體，進(jìn)一步調(diào)控其下游基因的表達(dá)。Chu等[11]研究發(fā)現(xiàn)CoCl2中二價(jià)鈷離子可以置換脯氨酰羥化酶輔助因子中的二價(jià)鐵離子抑制HIF-1α蛋白降解，因此HIF-1α的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后水平增強(qiáng)而非轉(zhuǎn)錄水平。

CXCR4是一種高度保守的G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中，包括細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、蛻膜間質(zhì)細(xì)胞及其他腫瘤細(xì)胞[12～14]。研究顯示，缺氧同樣可以促進(jìn)CXCR4的基因表達(dá)，其上調(diào)與多種腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)。同時(shí)，CXCR4也是一種缺氧反應(yīng)基因，基因啟動(dòng)子中存在著潛在的缺氧反應(yīng)元件(HRE)[15]。研究證實(shí)，HIF-1α可以直接結(jié)合到CXCR4基因啟動(dòng)子的HRE上，上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和遷移能力[16, 17]。Tang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，CoCl2誘導(dǎo)缺氧的條件下，人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WERI-Rb1細(xì)胞中CXCR4的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，與本研究結(jié)果基本一致。

本研究結(jié)果顯示，A組細(xì)胞缺氧狀態(tài)下沉默HIF-1α后，CXCR4 的mRNA和蛋白表達(dá)降低，說(shuō)明缺氧條件下沉默HIF-1α可有效下調(diào)CXCR4的表達(dá)。越來(lái)越多的證據(jù)表明，CXCR4可以促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞定向侵入母體蛻膜組織，增強(qiáng)胚胎植入和胎盤形成中滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜細(xì)胞間的相互作用，而蛻膜間質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的調(diào)控因子誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，對(duì)胎盤形成及妊娠結(jié)局起著決定性的作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4與其配體CXCL12相結(jié)合可激活TAK2/ATAT3信號(hào)和MEK/ERK1/2信號(hào)，進(jìn)一步促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移。此外，滋養(yǎng)細(xì)胞還可通過(guò)分泌CXCL12誘導(dǎo)妊娠期自然殺傷細(xì)胞的募集，并產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移。因此，我們進(jìn)一步通過(guò)Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和劃痕遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了缺氧和常氧條件下及HIF-1α沉默前后滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的變化，結(jié)果顯示JEG-3細(xì)胞的侵襲和遷移能力在缺氧微環(huán)境較常氧條件顯著增強(qiáng)，而沉默HIF-1α后A組細(xì)胞侵襲和遷移能力較對(duì)照組降低。表明沉默HIF-1α基因可以有效下調(diào)CXCR4的表達(dá)，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，缺氧微環(huán)境中HIF-1α沉默可抑制JEG-3細(xì)胞侵襲、遷移能力，其機(jī)制可能與HIF-1α下調(diào)細(xì)胞CXCR4表達(dá)有關(guān)。缺氧微環(huán)境中CXCR4如何調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移還有待進(jìn)一步的探討。CXCR4基因可能是子癇前期分子治療的潛在靶向基因，為未來(lái)子癇前期的靶向治療提供一個(gè)新方向。

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