蛋白芯片法與化學(xué)發(fā)光法在檢測(cè)消化道腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性分析

馬永能，彭秀娟，楊自力，劉姍，任皓月，曾華軍，陳娟娟，劉國(guó)雄

(綿陽市第三人民醫(yī)院（四川省精神衛(wèi)生中心）檢驗(yàn)科，四川 綿陽 621000)

腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤發(fā)生和增殖過程中異常升高的能反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。腫瘤標(biāo)志物在正常人含量很低，當(dāng)腫瘤發(fā)生時(shí)其在血液中的濃度明顯升高。由于單個(gè)腫瘤標(biāo)志物對(duì)相關(guān)疾病的診斷靈敏度和特異性的問題，采用多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)能提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，減少漏診和誤診[1-3]。目前蛋白芯片法由于其具有多指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于腫瘤高危人群的篩查、腫瘤病人術(shù)后的復(fù)發(fā)評(píng)估中。蛋白芯片法是基于蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)與化學(xué)發(fā)光免疫分析法聯(lián)合檢測(cè)人血清中的多種腫瘤標(biāo)志物，如CA19-9、CA125、T-PSA、F-PSA、NSE、AFP、CEA、CA724、Cyfra21-1、PG I、PG II、pro-GRP 等 12 種腫瘤標(biāo)志物。能對(duì)常見的腫瘤（肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、前列腺癌等）進(jìn)行臨床輔助診斷及治療效果的預(yù)后監(jiān)測(cè)。

消化道腫瘤是常見的惡性腫瘤之一，其相關(guān)標(biāo)志物 CA19-9、AFP、CEA、CA724 被廣泛關(guān)注[4-6]。本文擬采用蛋白芯片和本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用成熟的化學(xué)發(fā)光法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)蛋白芯片多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)法與本實(shí)驗(yàn)室已開展成熟的的貝克曼化學(xué)發(fā)光儀和羅氏電化學(xué)發(fā)光法在單一消化道腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)上的可比性。

1 資料與方法

1．1 試驗(yàn)對(duì)象 正常對(duì)照組：選擇健康體檢者，該組人群無明確的腫瘤病史和其他常見慢性疾病史，相關(guān)常規(guī)體檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果均在正常范圍內(nèi)。良性疾病對(duì)照組：選擇的血清樣本來源于患有除惡性腫瘤外的其他消化道疾病的住院病人。這些良性疾病包括肝炎、肝硬化、胃潰瘍、萎縮性胃炎、腸炎等。因?yàn)檠装Y的存在，該組患者的血清樣本可能會(huì)出現(xiàn)單一檢測(cè)結(jié)果陽性。惡性腫瘤組：該組是臨床已確診的惡性腫瘤患者，包括：食道癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌消等化道腫瘤患者。

1．2 樣本的采集與保存 采集受試者血液3～5ml，3500r/min，離心10min分離血清，每份血清體積不小于500μl。溶血樣本和黃疸血樣本不宜檢測(cè)。盡量采用新鮮血清，若樣本當(dāng)天不檢測(cè)而在一周內(nèi)檢測(cè)，則應(yīng)放置在2～8℃保存；檢測(cè)前樣品應(yīng)與室溫平衡。

1．3 樣本的排除標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)剔除標(biāo)準(zhǔn) 溶血、高膽紅素、高血脂或黃疸血的樣本；類風(fēng)濕因子陽性的樣本。

1．4 試劑和方法 蛋白芯片法試劑：江蘇三聯(lián)生物工程有限公司生產(chǎn)的SLXP-001型全自動(dòng)生物芯片閱讀儀及配套的蛋白芯片試劑盒。標(biāo)準(zhǔn)方法試劑及儀器：⑴羅氏診斷產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物定量檢測(cè)試劑盒：CA724試劑及其定標(biāo)品，儀器為Roche電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀Cobas e 411；⑵貝克曼有限公司生產(chǎn)的腫瘤標(biāo)志物定量檢測(cè)試劑盒（CA19-9、AFP、CEA等）及其定標(biāo)品，儀器采用DXI800全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。以上操作均按相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)品說明書和本實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行。室內(nèi)質(zhì)量控制 （精密度控制）采用伯樂第三方質(zhì)控品，按照質(zhì)量管理體系控制室內(nèi)質(zhì)量控制；參加衛(wèi)生部室間質(zhì)量評(píng)價(jià)評(píng)價(jià)各檢測(cè)項(xiàng)目的準(zhǔn)確性。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1．5．1 定性結(jié)果的一致性分析 對(duì)檢測(cè)結(jié)果的陰陽性判斷，對(duì)照方法（考核試劑盒）采用的試劑盒以“男芯”試劑盒提供的參考數(shù)值為判斷依據(jù)，標(biāo)準(zhǔn)方法（參比試劑盒）采用的試劑盒則以廠家提供的單指標(biāo)檢測(cè)設(shè)定的參考值（Cut off）作為判斷依據(jù)，詳見表1。

表1 腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)的陰陽性判斷截域參考值（Cutoff）

1．5．2 統(tǒng)計(jì)單個(gè)指標(biāo)的陽性檢出率，陽性一致率、陰性一致率、總符合率。以四格表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測(cè)結(jié)果并對(duì)結(jié)果進(jìn)行四格表的kappa檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。

1．5．3 建立回歸方程并分析 用回歸分析驗(yàn)證兩種試劑結(jié)果的相關(guān)性，以y=a+bx和R2的形式給出回歸分析的擬合方程，其中：y是對(duì)照方法的試劑檢測(cè)結(jié)果，x是標(biāo)準(zhǔn)方法的試劑檢測(cè)結(jié)果，b是方程斜率，a是y軸截距，R2是判定系數(shù)，同時(shí)應(yīng)給出b的95%置信區(qū)間，定量值結(jié)果應(yīng)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2．1 兩種試劑盒測(cè)定結(jié)果 分別用對(duì)照試劑（蛋白芯片）與標(biāo)準(zhǔn)試劑（貝克曼/羅氏）對(duì)血清樣本進(jìn)行消 化 道 常 見 腫 瘤 標(biāo) 志 物 （CA19-9、AFP、CEA、CA724）測(cè)定，它們的檢測(cè)結(jié)果如表2所示：

表2 樣本類型分組測(cè)定結(jié)果

惡性腫瘤組消化道癌（包括食道癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、賁門癌、胃癌）、肝癌以及其它癌癥等。相關(guān)良性疾病組消化道器官疾病，包括腸梗阻、腸息肉、腸瘺、腸炎、胃炎等。

2．2 兩種方法檢測(cè)常見腫瘤的陽性率 兩種試劑盒檢測(cè)常見腫瘤的陽性率見表3。

表3 腫瘤組中常見腫瘤的陽性率

2．3 兩種方法測(cè)定值常見腫瘤的陽性率定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析表 4a，b，c，d。

2．4 以對(duì)照方法（考核試劑）作Y軸，標(biāo)準(zhǔn)方法（參比試劑）作X軸，作散布圖如下。從相關(guān)系數(shù)r和散點(diǎn)圖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可看出，兩種產(chǎn)品的相關(guān)性較好。

表4a兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CA19-9

表4b兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-AFP

表4c兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CEA

表4d兩種方法定性判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)-CA724

4 討論

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)已成為繼影像學(xué)和病理學(xué)診斷之后臨床最常用的腫瘤診斷方法，在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸以及評(píng)價(jià)療效等方面具有較高的實(shí)用價(jià)值。

采用放射免疫分析或化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測(cè)血清中的腫瘤標(biāo)志物，是高危人群篩查、腫瘤病人治療或預(yù)后評(píng)估的常用的檢測(cè)手段。近年來采用的蛋白芯片聯(lián)合檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物，具有樣本用量少[7]，檢測(cè)通量大的優(yōu)點(diǎn)，在高危人群的篩查中越來越受到關(guān)注。

蛋白芯片法的檢測(cè)原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合后在固相基質(zhì)上結(jié)合腫瘤標(biāo)志物的抗體，捕獲被檢血清中對(duì)應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，再通過特定的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號(hào)，檢測(cè)光信號(hào)從而檢測(cè)血清中的腫瘤標(biāo)志物[8]，具有微型化、高速度、高通量、高靈敏度等特點(diǎn)，其對(duì)腫瘤的早期診斷和預(yù)后監(jiān)測(cè)具有輔助作用[9]。盡管蛋白芯片檢測(cè)有諸多優(yōu)點(diǎn)，但蛋白芯片的應(yīng)用也有一定爭(zhēng)議，有研究者表示其與單個(gè)血清腫瘤標(biāo)志物比較存在一定的假陽性[10]，分析其可能的原因可能是不同的抗體反應(yīng)需要的時(shí)間是不一樣的，而蛋白芯片法將多種抗體置于同一基質(zhì)片采用相同的時(shí)間反應(yīng)，會(huì)帶來結(jié)果的影響[11]。

腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)是診斷消化道惡性腫瘤的重要參考依據(jù)，對(duì)于消化道腫瘤的診治和預(yù)后判斷具有重大意義[12]，研究者們對(duì)腫瘤標(biāo)志物在消化道腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)中廣泛關(guān)注[13]。然而單獨(dú)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物具有一定局限性，本研究目的是探討多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)胃消化道腫瘤的早期診斷價(jià)值和兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的可比性。對(duì)CEA的研究表明CEA在多種腫瘤患者血清中都可表現(xiàn)為升高，尤其是胃腸道腫瘤，并且較高血清CEA水平的胃癌有較高的轉(zhuǎn)移率[14-17]。CA724是目前公認(rèn)較好的胃癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物[18]，研究顯示CA724可作為胃癌轉(zhuǎn)移的一項(xiàng)敏感腫瘤標(biāo)志物[19]。CA199屬于血液循環(huán)的胃腸道腫瘤相關(guān)抗原[20]，在殘胃癌、無法手術(shù)切除的患者中陽性率為64．9%[21]，聯(lián)合檢測(cè)有利于提高疾病診斷敏感性和特異性。本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)不同人群（包括惡性腫瘤組、良性疾病組和正常人群）的血清標(biāo)本采用蛋白芯片法和傳統(tǒng)的貝克曼化學(xué)發(fā)光法和羅氏電化學(xué)發(fā)光法單指標(biāo)腫瘤標(biāo)志物測(cè)定的結(jié)果作比較，探討蛋白芯片法在本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可行性。研究結(jié)果顯示對(duì)照試劑（蛋白芯片）與標(biāo)準(zhǔn)試劑（貝克曼/羅氏）對(duì)血清樣本進(jìn)行消化道常見腫瘤標(biāo)志物 CA19-9、AFP、CEA、CA724測(cè)定具有高度的一致性性：CA19-9符合率93．55% ；AFP 符 合 率 99．04% ；CA724 符 合 率95．50%；CEA 符合率 100．00%。

本臨床研究中僅很少數(shù)樣本檢測(cè)結(jié)果存在差異。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)兩種方法測(cè)值存在差異的樣本進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，復(fù)測(cè)結(jié)果與原值部分不相符，對(duì)不符合的樣本進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)測(cè)定值在參考值范圍的上限或下限附近，存在“灰區(qū)”效應(yīng)。因兩種方法正常值范圍不盡相同，而且可能存在人群、地區(qū)等的差異。

綜上所述，蛋白芯片法聯(lián)合檢測(cè)CA19-9、AFP、CEA、CA724與化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)單個(gè)腫瘤標(biāo)志物具有高度一致性，蛋白芯片法可用于消化道腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測(cè)，為臨床在消化道疾病的治療和預(yù)后上采取準(zhǔn)確的治療措施提供重要數(shù)據(jù)。

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