熄風膠囊對匹羅卡品IE大鼠血液及腦細胞外 液卡馬西平藥物濃度影響的實驗研究

吳超，李新民，張喜蓮，路巖莉，房艷艷，聶坤，劉菁

(1.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193;2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

血腦屏障由毛細血管內(nèi)皮細胞、細胞間緊密連接、基膜、周細胞、星型膠質(zhì)細胞足突及極狹小的細胞外隙共同組成[1]，它是血液與腦組織之間的天然屏障，能維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。但也由于其屏障作用，使得諸多以腦組織海馬區(qū)為靶點的抗癲癇藥物難以透過血腦屏障發(fā)揮作用，導致藥效顯著降低，癲癇的治療，尤其是難治性癲癇(Intractable Epilepsy，IE)的治療遭遇瓶頸。因此尋找增加血腦屏障通透性的藥物，提高腦組織中的藥物濃度也勢在必行。本實驗擬從研究熄風膠囊對一線抗癲癇藥物卡馬西平(Carbamazepine,CBZ)在難治性癲癇大鼠血液和腦細胞外液中的藥物濃度的影響入手，來進一步觀察熄風膠囊的具體療效，為其在難治性癲癇領域的更廣泛推廣提供理論與實驗依據(jù)。

1 難治性癲癇動物模型的建立

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(45±10)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供。

1.1.2 實驗藥品

氯化鋰(批號為115K1308，100 g/瓶，美國Sigma公司)；阿托品(批號為國藥準字H12020384，1 mL：5 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；鹽酸匹羅卡品(批號為066k1730，5 g/瓶，美國Sigma公司)；地西泮注射液(批號為國藥準字 0804032，2 mL∶10 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；熄風膠囊(制劑許可證號為津 ZX20010010，批號為津藥制字(2001)Z 第 0252 號，0.33 g/粒，天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院杏林藥廠)；卡馬西平(批號為國藥準字 H11022279，200 mg/片，北京諾華制藥公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本步驟

氯化鋰按127 mg/kg的劑量進行腹腔注射，18 h后硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后匹羅卡品30 mg/kg(濃度1%，首次20 mg/kg,30 min后10 mg/kg)腹腔注射，大鼠出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1 h后，再給與腹腔注射地西泮10 mg/kg解除抽搐，如癇性發(fā)作不能緩解，可重復注射地西泮1～2次，直到癇性發(fā)作被解除。

1.2.2 模型評價

0級：無反應；1級：耳面部抽搐；2級：肌陣攣，不伴直立位；3級：肌陣攣，伴直立位；4級：全身強直陣攣發(fā)作；5級：全身強直陣攣發(fā)作，伴失去體位。

癇性發(fā)作達到4及以上，解除癇性發(fā)作后狀態(tài)良好的大鼠為合格的模型。

1.2.3 實驗動物的分組及處理

1.2.3.1 分組

將造模成功的84只大鼠，隨機分為7組，每組12只：卡馬西平組、熄風膠囊低劑量組(熄低組)、熄風膠囊中劑量組(熄中組)、熄風膠囊高劑量組(熄高組)、熄風膠囊加卡馬西平組(熄卡組)、熄風膠囊加卡馬西平1/2劑量組(熄卡低組)、模型組；造模前隨機選取12只大鼠，作為正常對照組(空白組)。

1.2.3.2 灌胃

卡馬西平組：卡馬西平20 mg/kg；熄低組：熄風膠囊0.33 g濃縮劑2 mL；熄中組：熄風膠囊0.66 g濃縮劑2 mL；熄高組：熄風膠囊0.99 g濃縮劑2 mL；熄卡組：熄風膠囊0.66 g濃縮劑2 mL和CBZ 20 mg/kg；熄卡低組：熄風膠囊0.66 g濃縮劑2 mL和CBZ 10 mg/kg；模型組：生理鹽水2 mL；空白組：生理鹽水2 mL。

每天上午灌胃1次，共持續(xù)2個月。

1.2.3.3 監(jiān)控

采用影像監(jiān)控系統(tǒng)對所有實驗大鼠全程監(jiān)控并觀察各組大鼠反復自發(fā)性發(fā)作(Spontaneous Recurrent Seizures,SRS)的情況。

1.3 實驗結果

氯化鋰-匹羅卡品IE動物模型成功大鼠的行為學改變主要分為三期。急性期：腹腔注射匹羅卡品15～30 min后，大鼠出現(xiàn)凝視、濕狗樣抖動、陣發(fā)性耳面部抽搐、節(jié)律性點頭、雙側(cè)前肢陣攣、出汗、口中流涎，隨后出現(xiàn)劇烈狂奔、跳躍、跌倒，并出現(xiàn)伴直立體位甚至摔倒的全身強直性陣攣發(fā)作。發(fā)作時口吐泡沫、頭部后仰、尾部 上翹、四肢強直、全身肌肉劇烈抽搐，最終反復發(fā)作達到癲癇持續(xù)狀態(tài)(StatusEpileptieus，SE)。潛伏期：SE后2～14 d，主要表現(xiàn)為精神萎靡、消瘦、進食活動少，SRS較少。慢性期：SE后15～60 d，如前肢陣攣或面部抽搐等局部性發(fā)作，很快發(fā)展至全身強直性陣攣發(fā)作，持續(xù)時間一般不超過1 min，SRS均可自行終止。

表1 熄風膠囊對 IE 大鼠 SRS 的影響

注：與空白組比較，◆P<0.05；與模型組比較，■P<0.05；與CBZ組比較，▲P<0.05

如表1所示，空白組未見SRS發(fā)作，各實驗組均有SRS發(fā)作，與模型組比較，各治療組SRS發(fā)作次數(shù)均低于模型組(P<0.05)；與卡馬西平組比較，熄卡組和熄卡低組的SRS發(fā)作次數(shù)低于卡馬西平組(P<0.05)。

1.4 小結

本實驗成功復制了IE動物模型，選擇的動物為出生后16天大鼠，藥物干預至2月齡，相當于兒童的幼兒期至青春期，用于研究兒童期IE，采用的匹羅卡品劑量是小劑量多次重復注射，能夠達到發(fā)作級別且點燃率較高，死亡率較經(jīng)典用量明顯下降。并在實地及影像監(jiān)控系統(tǒng)中觀察到了IE模型大鼠的三期行為學表現(xiàn)，與人類IE行為學表現(xiàn)一致，熄風膠囊能減少有效控制IE大鼠SRS次數(shù)，且與卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)聯(lián)合治療時的效果優(yōu)于單純CBZ治療。

2 腦微透析液的收集與高效液相色譜法的檢測

2.1 材料

2.1.1 儀器

腦立體定位儀(68002，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；STRONG90+102顱骨鉆(SAESHIN PRECISION IND.CO.，韓國)；玻璃子體水門汀(批號：201506，上海醫(yī)療器械股份有限公司齒科材料廠)；微透析系統(tǒng)包括：CMA130體外固定支架，CMA402雙通道微量注射泵，CMA470低溫微量收集器，CMA120清醒活動裝置，1.0 mL玻璃微量注射器，均購自瑞典CMA/Microdialysis公司；五通轉(zhuǎn)環(huán)清醒活動裝置和ABS 型自動采血儀(Instech Laboratories,Inc，美國)；CMA 12微透析探針(膜長為4 mm，分子截留量20 kD)及MAB 14 IC探針導管(Microbiotech/se AB公司，瑞典)；YP2001N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。分析天平(Sartorius CPA2245，德國)，低溫離心機(Hettich Rotanta 460R，德國)。一次性使用靜脈輸液針(天津哈娜好醫(yī)材有限公司)，掌上離心機(Dragonlab D1008，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司)。

2.1.2 藥品與試劑

10%水合氯醛(水合氯醛，批號：20130201，國藥集團化學試劑有限公司)，生理鹽水(氯化鈉注射液，批號B14041607，山東康寧藥業(yè)有限公司)；人工腦脊液Ⅰ(批號：2014080301，湖州英創(chuàng)生物科技有限公司)；肝素鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號20120612)?？R西平標準品(SIGMA, cat: 94496)，用于體外回收率測定及給藥。色譜純甲醇(MeOH)購于Fisher公司，批號150940；色譜純乙腈(ACN)購于Fisher公司，批號148407；甲酸(HCOOH)購于CNW科技有限公司，批號L401K140；水，屈臣氏。以上藥品及試劑均在4℃冰箱保存。

2.1.3 動物

從卡馬西平組，熄卡組及熄卡低組各選取6只大鼠，IVC籠具(Tecniplast獨立通氣籠，意大利)，2只/每籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為23℃。

2.2 微透析套管的埋置

將灌胃2個月后的IE大鼠用10%的水合氯醛麻醉，根據(jù)包新民《大鼠立體定向圖譜》，定位在海馬區(qū)，在定位坐標處，顱鉆打孔，插入探針導管并固定，術后禁食，自由飲水。

2.3 探針體外回收率的測定

配置10 μg/mL的卡馬西平標準液，探針前端浸在溶液中，人工腦脊液流速2 μL/min，平衡1 h后，連續(xù)收集流出液每次30 μL,共3管。高效液相檢測出流出液藥物濃度。探針的體外回收率=流出液藥物濃度/標準液藥物濃度。本實驗的卡馬西平平均體外回收率為26.2%

2.4 微透析活體取樣

將微透析探針(膜長為4 mm，分子截留量20 kD)經(jīng)套管插入大鼠海馬區(qū)，微灌注泵恒定流速為2 μL/min。平衡1 h后，開始收集樣品，時間為給藥后15、30、45、60、90、120、150、180 min，每次25 μL。-80℃冰箱保存，2周內(nèi)進行高效液相檢測。

2.5 采集血漿樣品

大鼠麻醉后，頸總靜脈插管，于同一時間點，收集血液樣品，取完后離心，4 000 r/min，4℃離心10 min，取血漿50 μL，轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱內(nèi)。

2.6 血漿和腦透析液卡馬西平游離藥物濃度的測定

2.6.1 樣品的預處理

10 μL大鼠血漿樣品+10 μL乙腈/水+280 μL內(nèi)標(丁螺環(huán)酮100 ng/mL，甲醇/乙腈配制)，充分渦旋1 min，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，取上清溶液10 μL，用190 μL乙腈/水稀釋渦旋混勻，再取溶液40 μL,用160 μL乙腈/水稀釋渦旋混勻，進樣分析；10 μL透析液樣品+10 μL乙腈/水+280 μL內(nèi)標(丁螺環(huán)酮50 ng/mL，甲醇/乙腈配制)，充分渦旋1 min，4 ℃ 15 000 r/min離心10 min，取上清溶液10 μL，用190 μL乙腈/水稀釋渦旋混勻，進樣分析。

2.6.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax XDB-C18 column (3.5 μm，2.1 mm×50 mm)，S/N. USHP005327，流動相：A 0.1%FA-水；B乙腈，流速：0.45 mL/min，進樣量：10 μL，見圖1。

圖1 卡馬西平的標準色譜圖

2.6.3 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 樣品含量測定

根據(jù)高效液相色譜的分析方法，分別對各組大鼠血液和腦細胞外液中樣品進行分析，測定不同時間點的卡馬西平的濃度，并且繪制出平均藥時曲線。見圖2～4。

圖2 大鼠各組腦微透析液中卡馬西平樣品的色譜圖 A.卡馬西平組；B.熄卡組；C.熄卡低組

圖3 大鼠各組血液中卡馬西平樣品的色譜圖 A.卡馬西平組；B.熄卡組；C.熄卡低組

圖4 各組大鼠血藥濃度曲線圖

3.2 各組大鼠血液及腦細胞外液藥物濃度比較

與卡馬西平組相比，熄卡組中卡馬西平的血藥濃度在各個時間點略有升高，平均升高0.93%，但無統(tǒng)計學意義；熄卡組中卡馬西平的腦藥濃度在各時間點同樣有所升高，且升高幅度較大，平均升高31%(在30～90 min，P<0.05)。與熄卡組相比，熄卡低組的卡馬西平的血藥及腦藥濃度在各個時間點雖均降低，但高于熄卡組中卡馬西平濃度的一半(在15～90 min，P<0.05)。見表2～3。卡馬西平濃度的腦血比：卡馬西平組為0.055∶1；熄卡組為0.072∶1；熄卡低組為0.073∶1。

4 結論

熄風膠囊可能在促進卡馬西平的吸收方面有一定的作用，并且可能對低劑量的卡馬西平促吸收作用更強一些。

熄風膠囊可以增加大鼠卡馬西平腦細胞外液的藥物濃度，并且增加藥物濃度的腦血比值，說明其對開放血腦屏障、增加藥物的腦靶向性、促進藥物向腦組織分布可能有一定的作用。

熄風膠囊可能對低劑量的卡馬西平更加敏感，能夠適當減少卡馬西平乃至其它抗癲癇西藥的服藥量，降低卡馬西平等西藥的副作用與不良反應，增加藥物的安全性。

5 討論

5.1 難治性癲癇的耐藥機制與熄風膠囊的組方特點

癲癇是一組以大腦神經(jīng)元過度興奮同步異常放電所引起的反復發(fā)作性的短暫中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常為特征的慢性腦部疾病[2]，是我國的常見病，大部分患者通過正規(guī)的一線抗癲癇藥物的治療可以緩解癥狀，但是仍有三分之一的患者即使經(jīng)過一線抗癲癇藥物的治療，且血藥濃度在有效范圍內(nèi)，發(fā)作仍不能有效控制，每月發(fā)作4次以上，持續(xù)兩年，稱為難治性癲癇(IE)[3]。目前，導致難治性癲癇的治療不理想的根本原因，在于腦組織中的藥物濃度過低，達不到有效藥物濃度，而引起腦中濃度過低的原因中，血腦屏障的屏障作用是核心。已有研究表明，血腦屏障的屏障功能與P糖蛋白(PGP)和多藥耐藥基因1(MRP1)密不可分，PGP由MRP1編碼，存在于腦毛細血管內(nèi)皮細胞膜內(nèi)，是能量依賴性的外排泵，限制了許多化合物和代謝產(chǎn)物進入腦內(nèi)，被認為是血腦屏障功能維持的物質(zhì)基礎之一[4]，生理狀態(tài)下維持了腦內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定，也使許多抗癲癇藥物包括卡馬西平被迫被泵出細胞外，不能完全進入腦內(nèi)海馬旁發(fā)揮最大藥效。

表2 各組大鼠不同時間點血液卡馬西平藥物濃度的比較

注：與熄卡組比較，★P<0.05

表3 各組大鼠不同時間點腦細胞外液卡馬西平藥物濃度的比較

注：與卡馬西平組比較，▲P<0.05；與熄卡組比較，★P<0.05

中藥復方熄風膠囊組成為：紫河車、石菖蒲、天麻、川芎、全蝎、僵蠶、蜈蚣、白礬、郁金。方中紫河車益腎填精，補腦益智，可提高認知功能，以達治癇之本。天麻平肝潛陽、熄風止痙，辛潤不燥，一味兼具熄風豁痰之長，更配以石菖蒲辛香避穢、豁痰開竅，白金丸行氣除痰，川芎、郁金行氣活血，配以全蝎、蜈蚣，取其性善走竄，可入臟腑、經(jīng)絡以搜風剔痰逐瘀，以達治癇之標。諸藥合用，標本兼顧，扶正祛邪以治癇病頑疾。

5.2 熄風膠囊在本實驗中的藥理作用

前期研究已表明，熄風膠囊可以有效能夠降低MRP1的過度表達[5]，從而降低PGP的含量，增加血腦屏障的通透作用；也用臨床實驗證明了熄風膠囊對于難治性癲癇是有一定的療效的[6]。前期的研究從藥物的機制和藥物的最終效果上，間接的證明了其對血腦屏障的通透作用；而本實驗旨在從藥物的具體濃度來更直觀，更有力的反映這一點。從本實驗的結果看，熄卡組各時間點在血藥濃度方面，均比單用卡馬西平組略高，但無統(tǒng)計學意義；在腦藥濃度方面，同樣比卡馬西平組要高，在30～90 min有統(tǒng)計學意義，可見熄風膠囊在促進卡馬西平的吸收與加強其在腦組織中分布兩方面均有一定效果，血腦比值的比較也同樣說明了熄風膠囊增加了卡馬西平的腦靶向作用，促進藥物更多地向腦組織分布。而在熄卡組與熄卡低組的血液及腦細胞外液濃度比較中，熄卡低組的卡馬西平濃度在各時間點都高于熄卡組中卡馬西平濃度的一半(在15～90 min有統(tǒng)計學意義)，所以可以得出，熄風膠囊可能對低劑量的卡馬西平更加敏感，能夠減少卡馬西平的劑量，從而相應減輕它所帶來的各種不良反應?？R西平的療效指數(shù)小，安全度低，血藥濃度的個體差異大[7]，引起不良反應的形式多，從輕度的皮疹到嚴重的條件性皮疹，還有超敏綜合征、Stevens-Johnson綜合征和中毒性表皮壞死松解癥，服用卡馬西平前兩個月重型藥疹的發(fā)生率在1/1 000～10/1 000，死亡率高達30%以上[8]，所以需要盡可能的降低不良反應發(fā)生的風險。從本實驗結果來看，從藥動學來看，熄風膠囊可以增加血藥和腦藥濃度，直接反映了其對血腦屏障通透性的促進作用；從藥效學來說，熄風膠囊又可以降低卡馬西平的藥量，降低發(fā)生不良反應的風險,為中藥復方治療難治性癲癇提供了更多實驗及理論依據(jù)。當然，本實驗肯定有片面及不成熟的地方，以后將進一步探究熄風膠囊對于抗癲癇藥物的具體的藥動學參數(shù)，比如半衰期，清除率，表觀分布容積，平均駐留時間，生物利用度等的研究。

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