羊傳染性膿皰病毒PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

沙娜瓦爾·塔希，買(mǎi)買(mǎi)提艾力·斯迪克，李 舵，王 文，美熱木古麗·巴依待拉提，馬曉燕，蘇曉慧，盛卓君

（新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830001）

羊傳染性膿皰又稱為羊口瘡，是由痘病毒科副痘病毒屬的傳染性膿皰病毒（Contagious pustular dermatitis virus，CPDV）引起的，主要感染山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病[1]。該病在全世界范圍都可發(fā)生，主要危害3～6月齡羔羊，一般呈群發(fā)性流行；成年羊也能夠感染該病毒，但是一般不表現(xiàn)臨床癥狀，且往往呈散發(fā)性[2-3]?；疾⊙蛑饕R床癥狀為口腔黏膜、舌、唇等部位出現(xiàn)丘疹、紅斑、水皰、膿皰，膿皰破裂繼而發(fā)展成為爛斑，最后形成厚厚的疣狀痂塊[4]。這會(huì)導(dǎo)致患病羊出現(xiàn)采食困難，因營(yíng)養(yǎng)不良而死去?；疾「嵫蛟谒蔽秆蛉轭^時(shí)可以通過(guò)皮膚感染母羊，繼而母羊又傳播至公羊，給養(yǎng)羊業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)CPDV的檢測(cè)大多采用電子顯微鏡檢查（EM）、血清學(xué)檢查、病原分離等[5]。這些檢測(cè)方法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程繁瑣、敏感性低等不足。并且CPDV引起的臨床癥狀與山羊痘、口蹄疫等類似，如果再繼發(fā)細(xì)菌感染，就很容易造成誤診[3]。本研究根據(jù)GenBank中公布的CPDV毒株序列，通過(guò)多毒株B2L序列保守區(qū)的比對(duì)，設(shè)計(jì)并合成1對(duì)特異性引物，建立了特異性PCR檢測(cè)方法。采用此方法，對(duì)新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)的部分疑似感染CPDV的羊群進(jìn)行了檢測(cè)，以驗(yàn)證該方法的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1臨床待檢樣品 在新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)喀什、阿克蘇、和田、克州等區(qū)域采集的發(fā)病羊疑似病料。

1.1.2主要試劑 DL2000 DNA Marker、瓊脂糖、Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）、RNase-free Water、DNA提取試劑盒：購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中公布的CPDV毒株序列，通過(guò)多毒株（登錄號(hào)分別為 AY386264.1、AY386263.1、DQ184476.1、HM133903.1）B2L序列保守區(qū)的比對(duì)，利用Primmer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，預(yù)期PCR擴(kuò)增核酸片段大小為436 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。上游引物：P1 5′-GGGTCCGCGTTCTTCCACTC-3′；下游引物：P1 5′-GGTCCGTGTCCACCATCAAG-3′。

1.2 方法

1.2.1病毒核酸的提取 按照病毒核酸提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒核酸提??；提取之后將其置于4 ℃保存。對(duì)采集的羊唇部病變皮膚，首先用20 mmol/L的鹽酸鹽緩沖液進(jìn)行洗滌；然后用高壓滅菌剪刀剪碎，將其置于研缽中；用研磨棒充分研磨，加入一定量5%的雙抗（青霉素和鏈霉素），再加維持液（MEM培養(yǎng)基中加入1%的雙抗，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH至7.0制備而成）稀釋，3 000 r/min 離心10 min，取上清無(wú)菌過(guò)濾（用0.45微孔濾膜）；收集濾液并將其分裝至離心管；取出200 μL進(jìn)行DNA提取；最后將剩余濾液置于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PCR方法的建立 25 μL PCR反應(yīng)總體系：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）12.5 μL，上下游引 物 各 0.5μL（20 μmol/L），DNA 模 板 2 μL，RNase-free Water 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃ 5 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.3PCR擴(kuò)增的特異性試驗(yàn) 用建立的PCR方法分別檢測(cè)1.2.1中提取到的羊痘病毒、口蹄疫病毒、CPDV、小反芻獸疫病毒、藍(lán)舌病病毒，以及健康羊組織，檢測(cè)引物的特異性，同時(shí)用三蒸水作陰性對(duì)照。

1.2.4PCR擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn) 對(duì)CPDV模板DNA，用RNase-free Water連續(xù)作10倍梯度稀釋；用上述已建立并優(yōu)化好的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶的最低DNA模板量。該模板量即為最低檢出量。用核酸蛋白儀檢測(cè)最初模板濃度并計(jì)算出最初模板量。

1.2.5臨床樣品檢測(cè) 對(duì)采自新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)喀什、阿克蘇、和田、克州、巴州等區(qū)域發(fā)病山羊的48份疑似病料進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)的最佳條件

結(jié)果顯示：當(dāng)退火溫度為56 ℃時(shí)，目的條帶最亮，且清晰無(wú)雜帶（圖1）；當(dāng)引物量為0.6 μL時(shí)，目的條帶最亮，且雜帶較少，適合觀察（圖2）。因此，所建立的PCR檢測(cè)方法的最適退火溫度為56 ℃，最佳引物量為 0.6 μL。

2.2 特異性試驗(yàn)

將CPDV、羊痘病毒、口蹄疫病毒基因組DNA為PCR反應(yīng)模板，按照本試驗(yàn)中優(yōu)化好的反應(yīng)體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)僅CPDV為模板的反應(yīng)體系有大小約436 bp左右的條帶，其他毒株模板的反應(yīng)體系以及陰性對(duì)照組未見(jiàn)明顯條帶（圖3），表明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法具有高特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)

以CPDV DNA為樣本，測(cè)定OD260nm值，計(jì)算模板DNA含量；將CPDV模板DNA進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋10個(gè)梯度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)模板量為1 pg時(shí)（第7組）都可以擴(kuò)增出大小為436 bp的目的片段（圖4）。

圖1 PCR反應(yīng)退火溫度梯度優(yōu)化

圖2 PCR反應(yīng)引物優(yōu)化

2.4 臨床樣品檢測(cè)

對(duì)從新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)部分區(qū)域收集到的48份臨床發(fā)病羊疑似病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)45份顯示為CPDV陽(yáng)性（圖5），檢出率為93.8%，說(shuō)明該地區(qū)CPDV感染率較高，表明本試驗(yàn)建立的方法可以對(duì)臨床樣本進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

M. DL2000 DNA marker；1. 已知的CPDV樣品；2. 采集的疑似發(fā)病羊病料；3. 羊痘病毒；4. 口蹄疫病毒；5.小反芻獸疫病毒；6.藍(lán)舌病病毒；7. 健康羊組織；8. 陰性對(duì)照

圖4 PCR方法靈敏度

3 討論

傳染性口瘡病是羊群中的常見(jiàn)疫病之一，在大部分養(yǎng)羊國(guó)家曾發(fā)生過(guò)，在我國(guó)西北地區(qū)，尤其是新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)等養(yǎng)羊大省十分常見(jiàn)。該病在無(wú)繼發(fā)感染情況下，死亡率一般較低，但發(fā)病率較高，容易在羊群中流行。該病的流行會(huì)使羊群繁殖性能受到影響，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。傳染性口瘡病的發(fā)病癥狀與羊口蹄疫、羊痘相類似，容易混淆而造成誤診[6]。

圖5 臨床樣品檢測(cè)

近年來(lái)，新疆維吾爾自治區(qū)的羊養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，但主要以散戶、小型養(yǎng)殖戶為主，大型規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)較少。在放牧過(guò)程中，羊容易被草料劃傷唇部皮膚，并且小型羊場(chǎng)衛(wèi)生條件較差，防疫措施較落后，戶主又缺乏專業(yè)知識(shí)，因而容易將傳染性口瘡病與其他一些疾病，如口蹄疫、羊痘等混淆而造成誤診。對(duì)于輕微癥狀的羊如果不重視，疏于管理，就容易造成羊口瘡反復(fù)發(fā)作，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此，在羊養(yǎng)殖過(guò)程中，一定要做好羊口瘡防控工作。首先養(yǎng)殖戶主要足夠重視，對(duì)于癥狀輕微羊只，既要細(xì)心照料，加強(qiáng)護(hù)理，又要改善羊舍環(huán)境衛(wèi)生，保持羊舍清潔，及時(shí)清理羊舍糞便和其他異物，還要做好通風(fēng)工作[7-8]；要做好疫苗預(yù)防，定期對(duì)羊群進(jìn)行CPDV檢測(cè)，不從發(fā)生過(guò)該病的疫區(qū)引種，從源頭上杜絕羊口瘡的傳播與流行。

4 結(jié)論

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)退火溫度和引物濃度進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳反應(yīng)條件，通過(guò)對(duì)羊痘病毒、口蹄疫病毒、藍(lán)舌病病毒、小反芻獸疫病毒，以及空白對(duì)照的擴(kuò)增，表明建立的PCR檢測(cè)方法具有較高的特異性。敏感性試驗(yàn)表明，樣品DNA含量只有1 pg時(shí)，仍能擴(kuò)增出特異性目的條帶，說(shuō)明該P(yáng)CR檢測(cè)方法具有較高的敏感性。

本試驗(yàn)建立的PCR試驗(yàn)方法只需提取病料中的DNA，利用所設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，就可以擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段，具有高效、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。用本試驗(yàn)所建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)臨床采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，能夠迅速檢測(cè)出陽(yáng)性樣品，說(shuō)明本試驗(yàn)建立的PCR檢測(cè)方法適用于羊傳染性膿皰的臨床檢測(cè)，對(duì)于新疆維吾爾自治區(qū)南疆地區(qū)羊CPDV感染的確診和防控有重要意義。

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