草魚呼腸孤病毒生長特性研究

袁雪梅，姚嘉赟，郝貴杰，藺凌云，徐 洋，潘曉藝，尹文林，沈錦玉

（農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點實驗室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州 313001）

草魚（Ctenopharyngodon idella）是我國的主要淡水養(yǎng)殖品種。然而各種疾病的暴發(fā)嚴重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如出血性疾病、細菌性腸炎和細菌性敗血癥，給草魚養(yǎng)殖戶造成了巨大經(jīng)濟損失[1-2]。草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）是我國第1株分離鑒定的魚類病毒，也是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的毒株[3-4]。由其引起的草魚出血病是草魚養(yǎng)殖過程中的最大病害，死亡率高達60% 以上，嚴重影響了草魚養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[5]。因其危害性大、流行范圍廣、發(fā)病季節(jié)長，使該病一直為我國魚類病毒病的研究重點[4，6]。學者們就該病毒的流行病學、生物化學及分子生物學等進行了研究[7-8]。然而國際上對GCRV的研究與哺乳動物及禽呼腸孤病毒相比還有很大差距。研究病毒在體內(nèi)的復制增殖規(guī)律可進一步揭示GCRV分子致病機理，從而為該病防治奠定基礎(chǔ)。目前對于該病尚無有效治療方法，主要依靠疫苗預(yù)防。我國從20世紀70年代開始研究草魚出血病疫苗，研制出的組織疫苗和細胞疫苗在生產(chǎn)上收到了較好效果[9]。目前在疫苗生產(chǎn)過程中多使用細胞來增殖病毒。GCRV在細胞上繁殖速度較快，一般培養(yǎng)2～3 d即可觀察到細胞病變（Cytopathological effect，CPE）[10]。當前多使用CIK細胞來制備細胞疫苗，在病毒培養(yǎng)過程中多通過觀察細胞病變來收獲病毒。但這種方式并不能準確反映病毒在細胞中的增殖規(guī)律，往往錯過最佳收獲病毒時期，致使疫苗免疫效果不理想而造成經(jīng)濟損失。Real-time PCR技術(shù)具有靈敏度高、操作簡單、結(jié)果直觀、重復性好、特異性強等優(yōu)點，能夠精確分析病毒在細胞中的增殖規(guī)律，從而為生產(chǎn)細胞苗提供依據(jù)[11]。為此，本研究利用建立的Real-time PCR方法，對GCRV在CIK細胞及草魚體內(nèi)的增殖復制進行動態(tài)監(jiān)測，從而為GCRV致病機理研究和細胞滅活疫苗制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

M199培養(yǎng)基、胰酶：Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清：購自四季青公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTPs、T載體：購自TAKARA公司；Trizol Reagent：購于Invitrogen公司；DNA Marker：購自鼎國生物公司；SYBR Green熒光染料：購自TOYOBO公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒：購自愛思進公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞、毒株及試驗魚

草魚腎細胞系CIK、GCRV873由本實驗室保存。用于本研究的草魚購自浙江省淡水水產(chǎn)研究所苗種基地，體重為10～15 g，分別置于4個體積約300 L自動充氣水循環(huán)系統(tǒng)圓柱形水缸中飼養(yǎng)，每缸放40尾，飼養(yǎng)2周，水溫保持（26±1）℃；試驗期間每天投喂顆粒性餌料2次，投餌之前先吸污換水。

1.3 Real-time PCR檢測方法的建立

1.3.1引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中GCRV 873毒株 VP6蛋白編碼基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計特異性熒光定量引物VP6-U及VP6-L，同時針對草魚內(nèi)參基因β-actin序列設(shè)計特異性引物。引物序列（表1）由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1 GCRV熒光定量PCR引物序列

1.3.2標準品制備 收集 GCRV 873毒株CIK細胞培養(yǎng)物，按照Trizol說明書抽提RNA；用隨機引物反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別用引物VP6-U/VP6-L和β-actin-U/β-actin-L擴增病毒VP6基因及內(nèi)參基因β-actin。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，克隆于pMD-18T載體，并將陽性克隆送南京金斯瑞公司測序確認。對測序正確的陽性克隆抽提質(zhì)粒，測定濃度，按公式[11]計算質(zhì)粒標準品的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023。

1.3.3靈敏性試驗及標準曲線繪制 對重組質(zhì)粒10倍梯度稀釋后，進行熒光定量PCR擴增。參照SYBR Green熒光定量試劑盒說明書，分別取稀釋好的重組質(zhì)粒1 μL為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系為：2×SYBR GreenⅠPCR反應(yīng)混合液10 μL，10 pmol/L的上、下游引物各1 μL，加ddH2O補足20 μL。反應(yīng)采用三溫循環(huán)，程序為：95 ℃預(yù)變性 10 s；95 ℃變性 5 s，56 ℃退火 30 s；72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)，并收集熒光信號。

1.3.4特異性試驗 分別取GCRV 873毒株、傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV）、鯉魚春季病毒血癥病毒（SVCV）核酸，以其為模板進行Realtime PCR擴增，20 μL體系加模板1 μL，并設(shè)立陰性對照。

1.4 病毒培養(yǎng)與滴度測定

將保存于液氮中的GCRV 873毒株接種于長成致密單層的CIK細胞，28 ℃吸附1 h；吸棄病毒液，加入與培養(yǎng)液等量的維持液（含2%FBS的M199），28 ℃恒溫培養(yǎng)。每日觀察細胞形態(tài)，直至出現(xiàn)80%細胞病變，收取病毒液進行滴度測定。GCRV873的細胞培養(yǎng)液經(jīng)反復凍融后作連續(xù)10倍梯度稀釋，取10-3～10-108個稀釋度，每個稀釋度取100 μL的病毒液接種于96孔板上的單層CIK細胞；每稀釋度接種8孔，28 ℃孵育 1 h 后棄去，加入維持液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)正常細胞為對照，連續(xù)觀察7 d。根據(jù)病變情況，按Karber氏法計算半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。lgTCID50=L+ d（s?0.5）。式中：L為病毒最低稀釋度的對數(shù)，d為組距（稀釋系數(shù)），s為各組病變數(shù)與接種數(shù)比值之和[12]。

1.5 GCRV 873株在CIK細胞上的生長特性研究

CIK細胞培養(yǎng)于24孔細胞板，待細胞長至致密單層時，棄去培養(yǎng)液，用1×104TCID50/mL，每孔100 μL的GCRV 873毒株感染細胞。感染后分別 于 0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h 收取病毒細胞培養(yǎng)液，應(yīng)用建立的Real-time PCR方法檢測定各時間點的病毒RNA增殖情況，并通過對各個時間點病毒滴度的測定，檢測病毒拷貝數(shù)，同時分別顯微鏡觀察0、12、24、36、48、72 h 的CIK病變情況。

1.6 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的生長特性研究

試驗魚用MS222溶液（1 mg/L）麻醉，每尾草魚腹腔注射TCID50為1×106的GCRV 0.1 mL，對照組每尾注射同等劑量的滅菌生理鹽水。于注射后1、2、3、5、7 d取樣，每組隨機選取4尾試驗魚，用MS222（1 mg/L）麻醉后，取其肝臟、脾臟、腎臟，用Trizol提取各組織RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用Real-time PCR方法測定肝臟、脾臟、腎臟中的病毒含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，查看擴增曲線和Ct值等；通過標準曲線換算得到樣品中內(nèi)參基因β-actin和病毒基因組的絕對拷貝數(shù)，再經(jīng)β-actin校正得到相應(yīng)的相對拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 Real-time PCR檢測方法的建立

用特異性熒光定量引物VP6-U/VP6-L對病毒核酸進行PCR擴增，將得到的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預(yù)期大?。?02 bp）一致，且特異性好（圖1）。將擴增片段克隆到pMD-18T后送測序，發(fā)現(xiàn)序列與Genebank上公布的序列一致。從不同稀釋度的標準品Real-time PCR擴增反應(yīng)（圖2）可以看出，從1×101～1×106個拷貝數(shù)的質(zhì)粒擴增曲線均呈“S”型，且與指數(shù)增長期的擴增曲線平行，反映出PCR的擴增效率相近，檢測靈敏度為1×101個病毒粒子。以質(zhì)粒拷貝數(shù)的對數(shù)為X軸，以Ct值為Y軸，根據(jù)兩者的相關(guān)性得到標準曲線Y=3.237×log（X）+39.63，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴增效率為103.7%。特異性試驗結(jié)果顯示（圖3），GCRV病毒核酸擴增曲線呈“S”型，而IHNV、SVCV及陰性對照均沒有擴增曲線，說明所建立的檢測方法特異性好。

圖1 引物VP6-U、VP6-L PCR擴增結(jié)果

2.2 GCRV 873株在CIK細胞中的生長特性

GCRV 873株吸附CIK細胞1 h后，分別在0、2、4、8、10、12、24、36、48、72 h 收取細胞病毒液。對各個時間點病毒滴度及RNA水平進行檢測（圖3），并通過顯微鏡觀察不同時間點細胞病變情況（圖4）。由圖3可以看出病毒在感染CIK細胞0～12 h期間，病毒RNA水平很低，上升不明顯，病毒滴度處于較低水平，上升趨勢也不明顯；12～24 h期間，病毒RNA和病毒滴度開始明顯上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，而病毒滴度在24～48 h期間明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，72 h時病毒滴度達到最高，為106.75TCID50/mL。GCRV 873株感染CIK后12 h時出現(xiàn)少量細胞聚集；24 h時，細胞聚集增多，出現(xiàn)空斑現(xiàn)象；36 h時，空斑變大；48 h時，細胞大量脫落；72 h時，細胞基本已脫落，只有零星細胞附著于板上（圖5）。

圖2 GCRV重組質(zhì)粒熒光定量PCR擴增反應(yīng)

圖3 GCRV熒光定量PCR特異性檢測的擴增反應(yīng)

2.3 GCRV 873株在草魚體內(nèi)的復制情況

GCRV 873株感染草魚后，其肝、脾、腎中的病毒RNA拷貝數(shù)變化如圖6所示。3個組織中的病毒RNA均呈先升后降趨勢，其中肝臟中的病毒RNA峰值位于感染后3 d，脾臟和腎臟峰值位于感染后2 d。3種組織中，病毒RNA峰值最高的為腎臟，肝臟次之，脾臟最低；肝臟、腎臟和脾臟中的病毒RNA分別在至感染后7、6、4 d時下降到趨近于零的水平。

圖4 GCRV 873株感染CIK細胞后病毒滴度與RNA復制水平變化規(guī)律

圖5 GCRV 873株感染CIK細胞后細胞病變情況

3 討論

本研究從病毒RNA拷貝數(shù)、子代病毒含量及細胞病變3個方面綜合分析GCRV在CIK細胞中的增殖過程。試驗結(jié)果表明，GCRV在感染CIK細胞的早期病毒RNA拷貝數(shù)及病毒滴度均處于較低水平，說明這一時期的病毒多為殘余的原代病毒及最先釋放出來的子代病毒；24～72 h期間，病毒RNA水平迅速上調(diào)，呈現(xiàn)對數(shù)增長，而病毒滴度在24～48 h期間呈明顯上升，之后趨于平穩(wěn)；對照48 h的細胞CPE發(fā)展完全，說明細胞被完全裂解，胞內(nèi)病毒得以釋放，使病毒滴度趨于平穩(wěn)。曾令兵等[13]利用組織培養(yǎng)微量滴定系統(tǒng)，研究GCRV-854毒株在CIK細胞上的繁殖過程，其動態(tài)曲線與本研究相似，但出現(xiàn)快速增殖的時間較本研究晚，說明不同毒株感染細胞的能力存在差異。鄒桂平等[14]在電鏡下觀察到GCRV在感染CIK細胞4 h以內(nèi)出現(xiàn)脫去部分外層衣殼的不完整病毒顆粒，感染8 h時漿胞內(nèi)出現(xiàn)大量亞病毒顆粒，無外層蛋白結(jié)構(gòu)，感染12～16 h后出現(xiàn)成熟的病毒粒子。丁清泉等[15]發(fā)現(xiàn)GCRV在感染細胞12 h后即開始增殖，24～72 h大量增殖，使細胞產(chǎn)生典型的細胞病變效應(yīng)，5 d左右達到最大增殖，此時病毒的滴度最高，以后逐漸平緩。分析病毒在細胞中的增殖過程，不僅反映出病毒的生長特性，還指示出收獲細胞培養(yǎng)的病毒材料的最佳時間。

應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)，實時監(jiān)測GCRV在草魚體內(nèi)的病毒拷貝數(shù)，為精確分析病毒在魚體中的增殖過程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本試驗采用的毒株GCRV 873株為1型。該毒株在體外細胞中培養(yǎng)可使細胞產(chǎn)生明顯病變，但是草魚感染后未出現(xiàn)發(fā)病死亡情況，而其肝、脾、腎中的病毒RNA水平出現(xiàn)短期上升后下降到對照水平的結(jié)果，也正與無發(fā)病死亡情況相符。殷亮[16]研究發(fā)現(xiàn)GCRV HZ08株在感染稀有鮈鯽后，脾臟和腎臟中的病毒RNA水平呈現(xiàn)先升后降趨勢，與本研究結(jié)果一致。丁清泉等[15]發(fā)現(xiàn)經(jīng)人工感染GCRV的魚體腎臟組織細胞內(nèi)，存在無外衣殼的未成熟病毒。毛樹堅等[17]觀察草魚出血病的病理切片發(fā)現(xiàn)在肝臟、肌肉、腎臟、脾臟、鰓等魚體組織中含有大量的病毒顆粒。在本研究對比3種組織中病毒RNA的含量，發(fā)現(xiàn)腎臟中的含量最高，提示在取樣檢測時，可優(yōu)先考慮腎臟組織。

圖6 GCRV 873株感染草魚后不同組織中病毒RNA復制水平的變化規(guī)律

4 結(jié)論

本研究顯示：GCRV 在感染CIK細胞12 h后病毒RNA和病毒滴度開始上升；24～72 h期間，病毒RNA急劇上升，病毒滴度則在24～48 h內(nèi)明顯上升，48 h后趨于平穩(wěn)，至72 h，病毒滴度達到最高，為106.75TCID50/mL。在感染CIK后36 h，所有細胞均已感染，72 h時，細胞基本上脫落。GCRV感染草魚后，均能在其肝、脾、腎中檢測到病毒，且病毒RNA均呈先升后降趨勢；腎臟中的病毒RNA含量最高，因此應(yīng)優(yōu)先采集腎臟組織進行檢測。

[1] 方 勤，丁清泉，汪亞平，等.兩株水生呼腸孤病毒部分特性的比較[ J]. 中國病毒學，2003，18（5）：464-467.

[2] AHNE W. Viral infectious of aquatic animals with special reference to asian aquaculture[J]. Annual review of fish disease，1994，4：375-388.

[3] 柯麗華，方 勤，蔡宜權(quán).一株新的草魚出血病病毒分離物特性[J]. 水生生物學報，1990，14（2）：153-159.

[4] 陳燕新，江育林. 草魚出血病病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)及其理化特性的研究[J]. 科學通報，1983，28：1138-1140.

[5] 毛樹堅，邵建忠，杭綺，等. 草魚出血病的病原研究[J]. 水產(chǎn)學報，1989，13（1）：1-4.

[6] 中國科學院武漢病毒研究所，中國水產(chǎn)科學院長江水產(chǎn)研究所，長沙市分所草魚出血病病毒研究協(xié)作組.草魚出血病病毒的電子顯微鏡觀摩初報[J]. 淡水漁業(yè)，1983（3）：39.

[7] 方勤，朱作言. 水生呼腸孤病毒研究進展[J]. 中國病毒學，2003，18（1）：82-86.

[8] 王 煒，趙桃英，方 如，等. 草魚出血病病毒多肽的免疫原性[J]. 中國病毒學，1995，10（2）：166-168.

[9] 葉雪平，楊廣智，羅毅志，等. 草魚出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗生產(chǎn)工藝的比較[J]. 中國獸藥雜志，1998，32（4）：9-12.

[10] 肖雪，顏其貴，歐 洋，等. 草魚呼腸孤病毒的研究進展[J]. 水利漁業(yè)，2006，26：107-109.

[11] 周 勇，曾令兵，范玉頂，等. 草魚呼腸孤病毒TaqMan real-time PCR檢測方法的建立[J]. 水產(chǎn)學報，2011（35）：774-779.

[12] 郭元吉，程小雯. 流行性感冒病毒及其實驗技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社，1997：109-115.

[13] 曾令兵，賀 路，左文功. 草魚出血病病毒854株的理化、生物學特性及基因組結(jié)構(gòu)[J].水產(chǎn)學報，1998，22（3）：279-282.

[14] 鄒桂平，方 勤. 草魚呼腸孤病毒在 CIK細胞中復制及形態(tài)發(fā)生的研究[J]. 中國病毒學，2000，15（2）：188-192.

[15] 丁清泉，余蘭芬，王學蘭，等. 草魚出血病病魚主要器官的超薄切片觀察及感染力的比較[J]. 水產(chǎn)學報，1990，14（1）：66-69.

[16] 殷 亮. 三株不同基因型草魚呼腸孤病毒生物學特性的差異分析[D]. 上海：上海海洋大學，2014：27-31.

[17] 毛樹堅，杭 績，陳漢民，等. 草魚出血病兩種病原病毒的細胞病理學觀察[J]. 海洋與湖沼，1988，l9（5）：435-438.