規(guī)模羊場(chǎng)環(huán)境氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性及其ERIC-PCR分型

鐘召兵，王 寧，孫紅華，楊夫會(huì)

（泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山東泰安 271000）

微生物氣溶膠可以借助空氣進(jìn)行擴(kuò)散和傳輸，引發(fā)人類和動(dòng)植物疾病的流行與傳播，如傳染病、過(guò)敏癥和中毒等[1]。畜禽中的許多重大烈性傳染病的傳播為氣源性傳播，其病原微生物形成氣溶膠后容易擴(kuò)散，并且傳播距離遠(yuǎn)。如1981年口蹄疫病毒（FMDV）從法國(guó)布列塔尼通過(guò)空氣傳播到英格蘭南部，導(dǎo)致英格蘭口蹄疫暴發(fā)[2]；2001—2002年在美國(guó)由于氣載炭疽引起了人的大批死亡[3]；肺炎克雷波氏菌可通過(guò)空氣傳播等。大量研究證明，人們要重視環(huán)境氣溶膠的危害。

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens），又稱魏氏梭菌，屬于腐生性厭氧芽胞致病菌，是引起畜禽猝死癥、壞死性腸炎、腸毒血癥和氣性壞疽的主要致病菌[4]，在自然界中廣泛分布，可見(jiàn)于土壤、污水、飼料、糞便及人畜胃腸道內(nèi)，是一種條件性致病菌[5]。由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的羊產(chǎn)氣莢膜梭菌病，主要表現(xiàn)為毒血癥，包括羊猝狙、羊腸毒血癥和羔羊痢疾等[3]。近年來(lái)，該病在我國(guó)的發(fā)病數(shù)量逐年增多，流行特點(diǎn)也由點(diǎn)狀散發(fā)發(fā)展為片狀散發(fā)，給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。該病病死率高，且不同菌型的產(chǎn)氣莢膜梭菌?；旌细腥?，導(dǎo)致原先使用的抗生素和疫苗隨著時(shí)間的推移耐藥性增強(qiáng)，對(duì)畜群的保護(hù)率越來(lái)越低，產(chǎn)氣莢膜梭菌病的暴發(fā)呈上升趨勢(shì)[7]。

大量研究表明，空氣中的微生物及其代謝產(chǎn)物（內(nèi)毒素、氨和硫化氫等）是影響動(dòng)物和人類健康的重要因素[8]。本研究應(yīng)用基因間重復(fù)序列 引 物PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-based PCR，ERIC-PCR）方法，分析空氣中氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌基因表型及耐藥性，為指導(dǎo)規(guī)模羊場(chǎng)臨床合理使用抗生素，以及感染防控方案動(dòng)態(tài)調(diào)整或修訂、監(jiān)測(cè)和控制耐藥產(chǎn)氣莢膜梭菌等提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 被研究羊場(chǎng)

采樣地點(diǎn)為泰安市的6個(gè)規(guī)模羊場(chǎng)（表1）。試驗(yàn)前使用VTTEK-32全自動(dòng)細(xì)菌分析儀系統(tǒng)進(jìn)行重新鑒定，質(zhì)控菌株參考銅綠假單胞菌株ATCC27853，大腸埃希氏菌ATCC25922作為對(duì)照株。

表1 羊場(chǎng)情況

1.2 樣品采集

采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ANDERSEN-6級(jí)空氣微生物樣品收集器（遼寧市應(yīng)用技術(shù)研究所）。收集器置于羊舍中央，放置高度為1 m，空氣流量是28.3 L/min，以血-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，驅(qū)動(dòng)時(shí)間根據(jù)不同衛(wèi)生條件設(shè)在1～5 min之間，2016—2017年在泰安市6個(gè)規(guī)模羊場(chǎng)分離氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌30株。

1.3 藥敏試驗(yàn)

采用美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）推薦紙片擴(kuò)散法（K-B法），選用以下抗生素藥敏紙片：氨芐青霉素、頭孢噻肟、先鋒霉素、諾氟沙星、阿米卡星、強(qiáng)力霉素、頭孢他啶、青霉素和慶大霉素。結(jié)果判定及質(zhì)量控制按2010年CLSI標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行（表2）。

表2 抗生素耐藥標(biāo)準(zhǔn)

1.4 同源性檢測(cè)

1.4.1細(xì)菌總DNA提取 細(xì)菌DNA提取按細(xì)菌基因組提取試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取后的產(chǎn)物于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2引物序列 ERIC1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′[10]。所有引物由上海生工生物有限公司合成。

1.4.3ERIC-PCR反 應(yīng) 體 系 10×PCR buffer（Mg2+free ）2.5 μL，MgCl2（2.5 mmol/L）2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.5 μL，上下游引物（25 μmol/L）各 1 μL，模板 DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。PCR基本反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性 95 ℃ 4 min、94 ℃ 30 s、36 ℃ 1 min、68 ℃ 8 min、10個(gè)循環(huán)，變性溫度上升到48 ℃、52 ℃分別設(shè)為15和10個(gè)循環(huán)，最后于68 ℃延伸16 min。瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色成像。

1.4.4數(shù)據(jù)處理 每個(gè)樣品的擴(kuò)增帶存在時(shí)賦值為“1”，不存在時(shí)賦值為“0”，用電泳圖像分析軟件（Gel image system，Version 4.00）自動(dòng)生成矩陣圖。采用非加權(quán)對(duì)數(shù)算術(shù)平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹(shù)狀圖。另外，每個(gè)分離株看作是一個(gè)分類學(xué)單位（Operational taxonomic unit，OUT），并且把相似性≥90%的菌株看作起源相同的菌株[11]。為了減少誤差，所有菌株在同一個(gè)反應(yīng)條件下一次完成，而且電泳也是在相同凝膠中一次完成。

2 結(jié)果

2.1 分離株對(duì)常用藥物的敏感性

參照《中華人民共和國(guó)獸藥典》選取9種針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌的藥物分別對(duì)分離的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其中對(duì)慶大霉素的耐藥性最強(qiáng)，耐藥率達(dá)到了86.7%，其次為青霉素，耐藥率為43.3%，再次為強(qiáng)力霉素（36.7%）、頭孢他啶（30%）和阿米卡星（23.3%），對(duì)其他藥物耐藥率為1.0%～16.7%（表3）。

表3 30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性

2.2 ERIC-PCR分型

30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌株的ERIC-PCR指紋圖譜的條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間。以相似系數(shù)0.8為分界線，30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌可以分為14個(gè)基因型，分別描述為Ⅰ、Ⅱ…XIII和XIV型，其中V型最多，有8株，占總菌株的26.7%。A9、A12、A13、A14、A15、B22和 B30菌株各自單獨(dú)成為1個(gè)型。所有氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株均具有大小約為1 000 bp的特異性條帶，最遠(yuǎn)親緣關(guān)系為70.0%，B26與B27號(hào)菌株親緣關(guān)系最近（圖1）。

圖1 30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌的ERIC-PCR聚類圖

3 討論與結(jié)論

抗生素在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用，對(duì)治療和預(yù)防動(dòng)物疫病、促進(jìn)生長(zhǎng)和提高畜牧業(yè)生長(zhǎng)效能等方面都起到了積極作用。但是，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性變得越來(lái)越嚴(yán)重。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)，與菌株長(zhǎng)期處于多種抗生素選擇壓的環(huán)境中，其耐藥基因通過(guò)染色體或耐藥質(zhì)粒在菌群間廣泛傳播或擴(kuò)散有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，30株臨床分離的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥率高，對(duì)慶大霉素幾乎耐藥，對(duì)青霉素耐藥率達(dá)43.3%。耐藥性較高的抗生素是獸醫(yī)臨床使用頻率較高的藥物，原因是養(yǎng)殖場(chǎng)過(guò)量使用抗生素或規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)飼料中長(zhǎng)期添加抗生素或促生長(zhǎng)劑。因此，本試驗(yàn)的藥敏數(shù)據(jù)為本地區(qū)用藥提供了一定參考，對(duì)建立和完善抗菌藥物臨床應(yīng)用和細(xì)菌耐藥預(yù)警機(jī)制具有重要意義。

臨床分離菌株的基因同源性分析對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查，特別是傳染源和傳播途徑的追蹤具有重要意義。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一系列的分子生物學(xué)分型方法，其中細(xì)菌基因間重復(fù)共有序列PCR（Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR，ERIC-PCR）分型技術(shù)是以腸桿菌科基因重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR，能擴(kuò)增出多態(tài)性DNA圖譜[12]。DNA條帶特征能反映出細(xì)菌整個(gè)基因組結(jié)構(gòu)的差異，能區(qū)別含有ERIC重復(fù)序列的不同菌種或株，因此具有很強(qiáng)的鑒別種乃至菌株的能力。ERIC-PCR作為行之有效的分子分型技術(shù)，是一種被廣泛應(yīng)用的分子流行性病學(xué)調(diào)查方法，有利于快速判斷出地區(qū)流行菌株及其傳播情況，從而為防控疫病提供重要參考[13]。

氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌間存在遺傳多樣性，不僅存在于同一個(gè)血清型的不同菌株之間，而且存在于大量不可分型菌株之間。相對(duì)于血清學(xué)分型，ERIC-PCR技術(shù)對(duì)菌株的描述和比較的區(qū)分能力更高。本研究結(jié)果顯示，30株氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌ERIC-PCR指紋圖譜條帶數(shù)為3～12，片段大小在0.1～4.5 kb之間，可清晰分為14個(gè)基因型，大部分來(lái)源于不同的克隆株，其中Ⅴ型菌株數(shù)量最多，III型和Ⅵ型次之，表明氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌在本地區(qū)規(guī)模羊場(chǎng)內(nèi)存在感染和流行，導(dǎo)致克隆株在不同羊場(chǎng)及個(gè)體間相互傳播。

本研究發(fā)現(xiàn)部分菌株的同源性可達(dá)99%以上（菌株B26和B27），此兩株在場(chǎng)G-5中采集到，說(shuō)明本研究所收集的氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌可能來(lái)源于同一克隆菌株，存在場(chǎng)內(nèi)克隆傳播，其耐藥譜特征也較為相似，但耐藥水平存在一定程度的差異，可能與該克隆株在不同感染個(gè)體所受到的抗生素選擇壓力的差異有關(guān)，使其能自行啟動(dòng)外排泵等抗藥機(jī)制以適應(yīng)生存環(huán)境。同一個(gè)規(guī)模羊場(chǎng)的基因型也有不同，不同羊場(chǎng)之間也存在相同的基因型。

規(guī)模羊場(chǎng)氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌多重耐藥現(xiàn)象比較嚴(yán)重，菌株之間存在很高的遺傳多樣性，克隆株在不同羊場(chǎng)及個(gè)體間相互傳播。不同環(huán)境和條件下同一種病原菌的基因型也存在一定差異，同一個(gè)規(guī)模羊場(chǎng)的基因型可有不同，不同羊場(chǎng)之間也可能存在相同的基因型。因此在規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)，要密切關(guān)注氣載產(chǎn)氣莢膜梭菌的監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)，防止場(chǎng)內(nèi)感染的進(jìn)一步流行和暴發(fā)，同時(shí)執(zhí)行嚴(yán)格場(chǎng)內(nèi)消毒制度。

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