小鼠肝炎病毒抗體ELISA和IFA檢測試劑盒真實性評價

張志妮，郭中敏，嚴(yán) 楚

（1. 中山大學(xué)，廣東廣州 510006；2. 廣州市白云區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所鐘落潭鎮(zhèn)分所，廣東廣州 510550）

小鼠肝炎病毒（（Mouse hepatitis virus，MHV）是一種高傳染性，可造成小鼠肝炎并在小鼠群中劇烈暴發(fā)并遍及全球的病毒[1]，屬日冕冠狀病毒科冠狀病毒屬，有囊膜，線性不分段的單股正鏈RNA病毒[1-2]，主要經(jīng)過空氣和接觸傳播。在自然界中，小鼠是其唯一易感動物。該病毒多數(shù)情況下引起亞臨床感染或慢性感染，應(yīng)激或機體抵抗力下降時可引起急性發(fā)病和死亡，是對實驗小鼠危害最為嚴(yán)重的病毒之一[2]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物 小鼠肝炎病毒檢測方法》（GB/T 14926.22—2001）規(guī)定的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光抗體試驗（Immunofluorescence assay，IFA）和免疫酶試驗（Immunoenzyme assay，IEA）。如ELISA檢測為陽性的樣品，經(jīng)IFA檢測仍為陽性，方可判為陽性結(jié)果。本研究分析了26份小鼠血清樣本的ELISA、IFA檢測結(jié)果，初步評價了兩種方法的真實性，為實驗動物房MHV日常監(jiān)測提供了借鑒。

1 材料與方法。

1.1 材料

MHV ELISA Kit：購自EBI-xpress Biotech International；小鼠肝炎病毒免疫熒光（IFA）試劑盒：購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司；待測樣品：近2年來自不同屏障設(shè)施的26份SPF級小鼠血清。

1.2 主要儀器

多功能酶標(biāo)儀：Multiskan Ascent，美國Thermo。智能型生物顯微鏡：LEICA DM5000B，德國Leica。恒溫振蕩儀：ZD-85，中國金壇富華。

1.3 檢測方法

1.3.1ELISA試劑盒 檢測過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測樣品按1∶50的體積比稀釋（待檢血清∶樣本稀釋液=10∶490），對結(jié)果使用Multiskan Ascent多功能酶標(biāo)儀于405 nm波長讀值。陰性對照血清、陽性對照血清均為試劑盒自帶。

1.3.2IFA試劑盒檢測 檢測過程依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。將26份待測樣品按1∶25的體積比稀釋（待檢血清∶樣本稀釋液=5∶120），使用LEICA DM5000B智能型生物顯微鏡對結(jié)果進(jìn)行判讀。陰性對照血清、陽性對照血清均為試劑盒自帶。鏡下判讀標(biāo)準(zhǔn)：僅有紅色細(xì)胞背景為“?”，僅見黃綠色熒光為“+”，可見明亮的綠色與黃色熒光為“++”，耀眼的綠色與黃色熒光為“+++”。

1.3.3檢測效果初步評價 根據(jù)檢測結(jié)果，首先制作四格表（表1），再根據(jù)表格數(shù)據(jù)計算相應(yīng)指標(biāo)。靈敏度=a/（a+c）×100%，特異度=d/（b+d）×100%，誤診率=b/（b+d）×100%，漏診率=c/（a+c）×100%，粗一致率，即準(zhǔn)確度=（a+d）/（a+b+c+d）×100%，約登指數(shù)，即正確指數(shù)=[a/（a+c）+d/（b+d）]–1，陽性似然比=[a/（a+c）]/[b/（b+d）]×100%，陰性似然比=[c/（a+c）]/[d/（b+d）]×100%[3]。

表1 ELISA、IFA檢測結(jié)果統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測

2.1.1結(jié)果有效性判定 陰性對照血清的陽性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對照抗原孔讀數(shù)必須＜0.250，陽性對照血清的陽性病毒抗原孔讀數(shù)減去陰性對照抗原孔讀數(shù)必須＞0.600，否則需重新檢測。本試驗試劑盒自帶陰性對照血清ΔOD為0.012，陽性對照血清ΔOD為2.883，證實有效（表2）。

2.1.2待測樣本結(jié)果判定 ΔOD=抗原孔讀數(shù)OD值?對照抗原孔OD值，ΔOD≥0.300，結(jié)果判為陽性（P），ΔOD＜0.300，結(jié)果判為陰性（N）。26份血清中，有15份陽性、11份陰性（表2）。

2.2 IFA檢測

2.2.1結(jié)果有效性判定 陰性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔和陰性對照細(xì)胞孔均為“?”，陽性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔判讀為“+～+++”，陰性對照細(xì)胞孔為“?”則本次試驗有效，否則需重新檢測。本試驗試劑盒自帶陰性對照血清陽性感染細(xì)胞孔和陰性對照細(xì)胞孔均為“?”，陽性對照血清的陽性感染細(xì)胞孔判讀為“++”，陰性對照細(xì)胞孔為“?”，證實有效（表2）。

2.2.2樣本結(jié)果判定 26份血清中，有13份顯示陽性，其中5份為“+”，8份為“++”，剩余13份血清結(jié)果顯示陰性（表2）。

2.3 ELISA和IFA檢測結(jié)果真實性評價

26份血清中，有13份均被ELISA和IFA檢測均為陽性、11份均為陰性，另2份分別為ELISA檢測陽性、IFA檢測陰性。根據(jù)表3統(tǒng)計結(jié)果，參比IFA，ELISA檢測試劑盒的真實性指標(biāo)為：靈敏度100%，特異度84.61%，誤診率15.38%，漏診率0，準(zhǔn)確度92.3%，正確指數(shù)0.846，陽性似然比650%，陰性似然比0。

表2 樣品的ELISA、IFA檢測結(jié)果

表3 ELISA、IFA檢測結(jié)果統(tǒng)計 單位：份

3 討論

MHV是我國清潔級或以上級別實驗小鼠應(yīng)排除的病原之一，是國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測》（GB 14922.2—2011）規(guī)定的必檢項目，2013年首次被納入新版《中華人民共和國進(jìn)境動物檢疫疫病名錄》。

1949年Cheever首次在后肢癱瘓小鼠腦中首次分離到MHV-JHM 株，隨后鑒定出其他毒株。我國1979年于裸鼠中發(fā)現(xiàn)并分離到該病毒[4]。近年來的血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，2004—2007年我國臺灣地區(qū)的MHV陽性率為3.4%～12%[5]，2000—2003年歐洲為12%，北美為1.59%[6]；2003—2007年我國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院的檢出率為3%～7%[7]，湖南省疾病預(yù)防控制中心在湖南省醫(yī)藥科研單位和藥廠飼養(yǎng)動物中的陽性檢出率為2.7%～6.8%[8]，廣東省實驗動物監(jiān)測所在廣東省6個屏障設(shè)施中的陽性檢出率為2%～13.7%[6]；2011年中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所在11家繁殖區(qū)域送檢的動物中均檢出陽性[9]；北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司在2012—2013年國內(nèi)送檢小鼠中的陽性檢出率高達(dá)19.9%[10]；2015年在廣東省舉辦的實驗動物質(zhì)量檢測交流會上，北京、上海和廣東監(jiān)督檢驗站報告在近5年來的檢測工作中均有陽性被檢出。雖然不同時間、不同單位的監(jiān)測結(jié)果不盡相同，但不難發(fā)現(xiàn)，MHV感染情況較為普遍，抗體陽性率較高。因此，對于MHV污染的防控，日常監(jiān)控尤為重要。

研究發(fā)現(xiàn)，小鼠人工感染MHV后，抗體產(chǎn)生周期短，持續(xù)時間長，5～7 d 內(nèi)IgG明顯升高，3周時達(dá)到高峰，維持到28 d后開始緩慢下降；而IgM水平上升時間更早，3 d開始升高，7 d達(dá)高峰，3周后開始下降[11]。而更換“臟墊料”法自然感染的ICR小鼠陽性抗體持續(xù)至84 d未見明顯降低；在接觸病原2 d內(nèi)，在肺臟中檢出病毒陽性，隨后在其他組織樣本均檢出陽性，14 d后，病毒檢出率開始下降，84 d后所有組織樣本中均未檢出病毒[12]。可見，抗原可作為早期檢測的輔助手段，而抗體檢測具有較高穩(wěn)定性，適用于MHV日常監(jiān)控，同時IgM亦可考慮用于早期感染的血清學(xué)檢測。

靈敏度高是ELISA、IFA的優(yōu)點。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.22—2001規(guī)定，MHV檢測方法為ELISA、IFA和IEA。鑒于IEA法抗原不易制備，而ELISA、IFA均有商品化檢測試劑盒，故對于日常大量樣本的MHV快速檢測，目前國內(nèi)檢測單位一般采用ELISA 初篩，陽性樣本用IFA進(jìn)行復(fù)檢。因此，選擇適合的ELISA、IFA檢測試劑盒尤為關(guān)鍵。

前期預(yù)試驗中發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)ELISA試劑盒檢測結(jié)果差強人意，故選擇了進(jìn)口試劑盒。13份檢測均為陽性的結(jié)果中，ELISA檢測數(shù)值大小與IFA不一致，估計為兩種檢測試劑盒包被的抗原不一致所致。

4 結(jié)論

本次試驗初步評價了ELISA和IFA兩種進(jìn)口試劑盒，反觀兩者符合度高。ELISA檢出率略高，有2份樣品ELISA檢測為陽性，但I(xiàn)FA檢測卻為陰性，進(jìn)一步證實了初篩使用ELISA方法的必要性；參比，IFA，ELISA試劑盒的靈敏度為100%，特異度為84.61%，準(zhǔn)確度為92.3%，正確指數(shù)為0.846，數(shù)據(jù)客觀真實，初步證實ELISA試劑盒配合IFA適用于動物房MHV抗體的日常監(jiān)測。但仍需擴大樣本量對該檢測方法的真實性進(jìn)行數(shù)據(jù)補充和修正，同時需應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行可靠性指標(biāo)檢測。只有這樣，才能較為客觀、真實地反應(yīng)檢測區(qū)域的MHV感染率。

[1] 赫什D C. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 王鳳陽，譯. 2版. 北京：科學(xué)出版社，1983.

[2] CHARLES B C，COSENTINO J M. Contemporary prevalence of infectious agents in laboratory mice and rats[J]. Laboratory animal，2009，43（2）：165-173.

[3] 崔相學(xué). 衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)[M[. 1版. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2009.

[4] 仇保豐，宋鴻雁，董蓉蓮，等. 鼠痘、小鼠肝炎和鼠仙臺病毒感染癥的國內(nèi)流行情況及防控對策[J]. 中國動物檢疫，2015，32（10）：9-14.

[5] LIANG C T. Microbial contaminations of laboratory mice and rats in taiwan from 2004 to 2007 [J]. Journal of the american association for laboratory animal science，2009，48（4）：381-386.

[6] 劉香梅，張鈺，趙維波，等. 廣東省屏障設(shè)施小鼠群中小鼠肝炎病毒感染情況[J] .中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（10）：72-74.

[7] 隋麗華，范薇，楊 敬，等. 實驗動物微生物、寄生蟲抽樣調(diào)查及分析[J]. 實驗動物與比較醫(yī)學(xué)，2008，28（4）：259-262.

[8] 黃凰，戴德芳，黃一偉，等. 湖南省2003—2007年實驗大、小鼠病毒學(xué)監(jiān)測結(jié)果[J]. 實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，15（6）：1926-1928.

[9] 魏巍，劉霄磊，劉家森，等. 大小鼠主要病毒血清抗體檢測結(jié)果與分析[J]. 實驗動物科學(xué)，2011，28（6）：23-25.

[10] 王翠娥，陳立超，周倩，等. 實驗大鼠和小鼠多種病毒的血清學(xué)檢測結(jié)果分析[J]. 實驗動物科學(xué)，2014，31（2）：20-24.

[11] 高駿，孫鳳萍，王勝昌，等. 實驗小鼠感染小鼠肝炎病毒后的抗體變化[J]. 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，23（1）：8-11.

[12] 劉香梅，趙維波，袁文，等. ICR小鼠自然感染小鼠肝炎病毒后抗原抗體的變化[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24（7）：37-40.