黃地吉仙片中金絲桃苷含量測定方法的建立

田蜜+陳芳+賀建昌

[摘要] 目的 為了提高黃地吉仙片的質量標準，建立高效液相色譜法（HPLC）測定其菟絲子含量，并對其進行重金屬及砷鹽的檢查。 方法 色譜柱Symmetry C18（5 μm，6 mm×150 mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：353 nm；進樣量10 μL。參考《中國藥典》（2010年）方法對重金屬、砷鹽進行雜質限量檢查。 結果 金絲桃苷在2.0～100.0 μg/mL范圍內，與峰面積呈良好的線性關系（R2 = 0.9998），平均回收率為75.61%。重金屬小于百萬分之十，砷鹽小于百萬分之二，與《中國藥典》（2010年）對中藥制劑重金屬、砷鹽的要求相符。 結論 HPLC測定金絲桃苷含量方法簡便，靈敏度高，重復性好，可用于黃地吉仙片中金絲桃苷的含量測定；黃地吉仙片的重金屬、砷鹽檢查符合要求，為臨床用藥安全提供了依據。

[關鍵詞] 黃地吉仙片；金絲桃苷；高效液相色譜法；含量；重金屬；砷鹽

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（c）-0122-04

[Abstract] Objective To improve the quality standard of Huangdi Jixian Tablets， high performance liquid chromatography （HPLC） method was established to detect the contents of hyperin and the contents of heavy metal and arsenic salt in Huangdi Jiexian Tablets were detected. Methods Symmetry C18 （5 μm， 6 mm×150 mm） column was used. The mobile phase contained acetonitrile and 0.1% phosphoric acid （18∶82）. The flow rate was 1.0 mL/min and the detection wavelength was 353 nm. The injection volume was 10 μL. In addition， the impurity of heavy metal and arsenic salt was also detected according to Chinese Pharmacopoeia （2010）. Results Within the range from 2.0 to 100.0 μg/mL， hyperin presented an ideal linear relationship with the peak areas （R2 = 0.9998）. The average recovery rate was 75.61%. Heavy metal was less than 10 parts per million and arsenic salt was less than 2 parts per million. These results conformed to the requirements of Chinese Pharmacopoeia （2010）. Conclusion HPLC method for determining the content of hyperin is simple， with high sensitivity and good repeatability， which can be used for the content determination of hyperin in Huangdi Jixian Tablets. The contents of heavy metal and arsenic salt are conformed to the requirement， which provides evidence for the safety of clinical medication.

[Key words] Huangdi Jixian Tablets； Hyperin； High performance liquid chromatography； Content； Heavy metal； Arsenic salt

黃地吉仙片為成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）研發(fā)的醫(yī)院制劑，由人參、熟地、菟絲子、蒼術、雞血藤等藥材制成，具有健脾補腎、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、降糖消脂的功效，運用于非胰島素依賴型糖尿病，并可用于胰島素依賴型糖尿病的輔助治療。經臨床使用多年，有顯著的效果及良好的安全性。原制劑質量標準中僅對君藥玄參、人參、佐藥大黃和使藥黃連、黃芪進行了薄層鑒別，無含量測定項，因此為更好地控制本制劑質量，現對黃地吉仙片的原質量標準進行完善，參考相關文獻[1-10]，采用高效液相色譜法（HPLC）測定菟絲子中金絲桃苷的含量。經方法學驗證，表明其方法簡便，重復性好，靈敏度高。參照《中國藥典》（2010年版）[11]重金屬檢查法和砷鹽檢查法及相關文獻[12-20]，對黃地吉仙片進行重金屬及砷鹽的檢查研究，以了解其重金屬及砷鹽是否超標，為臨床用藥的安全提供依據。

1 儀器與試藥

WATERS高效液相色譜儀（2695-2487，美國waters）；電子天平（BP121S，德國賽多利斯）；超聲機（SY1200-T，上海聲源超聲波儀器設備有限公司）；密理博純水機（Z00QSV001，德國默克密理博）。

鹽酸小檗堿（中國食品藥品檢定研究院，110713-201212，含量86.7%）；金絲桃苷（中國食品藥品檢定研究院，111521-201406，含量92.5%）；甲醇、磷酸為分析純；乙腈為色譜純；硝酸鉛（分析純）；酚酞指示劑；硫酸（分析純）；硝酸（分析純）；鹽酸（分析純）；醋酸鹽緩沖液（pH=3.5）；標準砷貯備液（100 μg/mL）；三氧化二砷（分析純）；氫氧化鈣（分析純）；碘化鉀（分析純）；氯化亞錫（分析純）；黃地吉仙片（我院生產，批號：150601、150602、150603）。endprint

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）；檢測波長為353 nm。理論板數按金絲桃苷峰計應不低于5000。

2.1.2 樣品制備

2.1.2.1 對照品溶液的制備 取對照品金絲桃苷適量，精密稱定，用甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液，即得。

2.1.2.2 供試品溶液的制備 取本品，研細，精密稱定6 g，加80%甲醇50 mL，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，稱定重量，80%甲醇補足減少的重量，搖勻，濾過，續(xù)濾液用0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 取不含菟絲子的陰性樣品按“1.2.2.2”同法制備。

2.1.2.4 檢測波長的選擇 將金絲桃苷對照品溶液（100 μg/mL）在200～400 nm下全掃，254.1 nm及353.2 nm有最大吸收。又因在353 nm下樣品的干擾峰最小，所以最終確定掃描波長為353 nm。與《中國藥典》（2010年版）[11]菟絲子項下一致。

2.1.3 專屬性試驗

取陰性對照樣品照含量測定方法進行試驗，色譜圖見圖1。結果表明，在對照品主峰相應位置上陰性對照樣品無色譜峰，樣品與對照品主峰保留時間一致，說明該項檢測專屬性良好。

2.1.4 線性關系考察

精密稱定適量金絲桃苷對照品，用甲醇配置成2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/mL的對照品溶液，注入高效液相色譜儀，進行含量測定。以峰面積（A）為縱坐標（Y），金絲桃苷的濃度（μg/mL）為橫坐標（X），繪制標準曲線，得到回歸方程：Y = 20455X + 31 162，R2 = 0.9998。結果顯示，黃地吉仙片金絲桃苷含量在2.0～100.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗

取濃度為20 μg/mL的金絲桃苷對照品溶液連續(xù)測定6次，結果見表1。結果RSD%為0.24%，小于2%。表明該法精密度良好。

2.1.6 重復性試驗

取同一批號（150601）樣品6份，按照“1.2.2.2”項下供試品制備方法制備測定，結果見表2。RSD為0.83%，小于2%。表明該法重復性良好。

2.1.7 加樣回收試驗

精密稱取同一批（150601）樣品6份，分別加入一定量的金絲桃苷對照品，按照“1.2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，各取10 μL進樣，計算加樣回收率，結果見表3，金絲桃苷的平均回收率為75.61%，RSD%為2.69%，表明該方法較準確可靠。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液（150601），分別在0、2、4、6、8 h進樣，記錄峰面積。結果峰面積平均值為433 579，RSD為0.42%。表明供試品溶液在8 h內穩(wěn)定。

2.1.9 含量測定

取3批樣品，每批樣品平行制樣2份進行含量測定，結果見表4。

2.2 重金屬及砷鹽檢查

2.2.1 檢測方法

參照《中國藥典》（2010年版）[11]一部附錄重金屬檢查法（IXE）、砷鹽檢查法（IXF），進行三批樣品中重金屬和砷鹽的測定，并按測定方法制備儀器空白溶液及試劑，分別按照上述重金屬、砷鹽的檢查方法進行陰性空白樣品的測定。

2.2.2 樣品測定

2.2.2.1 重金屬檢查 取3批樣品，按上述方法測定，供試品溶液、空白對照溶液的顏色均比對照品溶液淺，測定結果見表5。

2.2.2.2 砷鹽檢查 取3批樣品，按上述方法測定，供試品及空白對照樣品的砷斑顏色均比標準砷斑淺，測定結果見表6、圖2。

3 討論

3.1 金絲桃苷的含量測定

從3批樣品測定結果看，含量最高為0.1594 mg/g，最低為0.1538 mg/g，平均值為0.1570 mg/g。本品每片重0.3 g，因此，將本品的金絲桃苷含量定為每片不得少于0.3 g×0.1570 mg/g×80%=0.03768 mg。本品每片含菟絲子以金絲桃苷計（C21H20O12），不得少于0.03 mg。

在含量測定中，對流動相乙腈-0.1%磷酸水的不同比例進行了考察，結果以乙腈-0.1%磷酸水（18∶82）為最佳，基線平穩(wěn)，金絲桃苷的色譜峰分離最好，峰形最好。

在質量標準提升過程中，首先對君藥人參進行了人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量測定研究。實驗結果表明，在對照品出峰處，陰性樣品有干擾，因此將人參的含量測定排除，進行了菟絲子中金絲桃苷的研究。

3.2 重金屬及砷鹽的檢查研究

中藥新藥制劑若重金屬<10 ppm，砷鹽<2 ppm，可以不收入質量標準中[20]。因此未將此部分列入黃地吉仙片的質量標準中。中藥重金屬及砷鹽的質量控制在種植、制劑、炮制加工、貯藏與運輸等全過程都應重視。近些年來，環(huán)境污染越來越嚴重，要控制好中藥及其成方制劑的重金屬及砷鹽等超標的情況，須從源頭抓起，因此我院在中藥自制制劑的原材料采購時嚴把關，并從輔料、生產、運輸等多個環(huán)節(jié)控制，保證制劑的質量和安全。

[參考文獻]

[1] 鄭一敏，胥秀英，楊艷紅，等.HPLC測定菟絲子中金絲桃苷與槲皮苷的含量[J].華西藥學雜志，2005，20（3）：261-262.

[2] 孫笑宇，程序，賈天柱.HPLC法優(yōu)選不同產地菟絲子[J].中國現代藥物應用，2013，7（13）：221-223.endprint

[3] 田雨霏，劉嬌，李晉，等.高效液相色譜法測定菟絲子中綠原酸、對-香豆酸和金絲桃苷的含量[J].天津中醫(yī)藥大學學報，2014，33（6）：372-374.

[4] 李懷國，葉家宏，李子鴻，等.HPLC法同時測定菟絲子中5種成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2014，25（1）：64-67.

[5] 韓霖，劉研如，楊建云，等.貫葉連翹提取物中金絲桃苷含量的RP-HPLC法測定[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（10）：2432-2434.

[6] 李秋莉，劉艷芳，閆夢曉，等.不同工藝炮制酒菟絲子時4種主要活性成分動態(tài)變化[J].中國藥師，2016，19（10）：1882-1884.

[7] 周華春，周仲霞.HPLC同時測定菟絲子不同炮制品中5種主要活性成分含量[J].世界中醫(yī)藥，2015，10（A01）：78-79.

[8] 劉艷芳，姚惠鳳，陳文舉，等.不同炮制工藝鹽菟絲子中4種黃酮類成分的定量分析[J].中國藥房，2016，27（15）：2128-2130.

[9] 雷昌，孟盼，謝瑜，等.HPLC法同時測定百事樂膠囊中5種成分的含量[J].中藥材，2017，40（1）：143-146.

[10] 沙拉麥提·艾力，王亞麗.菟絲草質量標準研究[J].中國藥事，2017，31（5）：501-505.

[11] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[12] 李敏，劉渝，周睿，等.國內外有關中藥中重金屬和砷鹽的限量標準及分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2007，18（11）：2859-2860.

[13] 韓潔，鄒金凱.含重金屬元素中藥制劑的安全性探討[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（8）：2665-2666.

[14] 元偉，張皓.風熱感冒顆粒重金屬、砷鹽檢查方法研究[J].北方藥學，2012，9（8）：10-11.

[15] 戴筱瑛，賴娟華，劉良玉，等.舒筋活血丸中重金屬與砷鹽檢查[J].江西中醫(yī)藥，2011，4（42）：77-78.

[16] 張麗鳳，包小妹，盛華，等.蒙藥材黃礬的質量標準研究[J].內蒙古醫(yī)科大學學報，2017，39（2）：145-147.

[17] 王春華.4種中藥醫(yī)院制劑重金屬與砷鹽的考察[J].實用中西醫(yī)結合臨床，2009，9（1）：86-87.

[18] 陳遠航.枸杞等6種中藥的重金屬檢測研究[J].中國醫(yī)藥導報，2007，4（7）：144-145.

[19] 張曉平，張文平，牛鳳菊，等.石蟹質量標準研究[J].山東中醫(yī)雜志，2015，34（3）：211-213.

[20] 周躍華.中藥新藥質量標準研究中常見問題淺析[J].中成藥，2004，26（11）：972-975.

（收稿日期：2017-10-02 本文編輯：張瑜杰）endprint