基于Miseq測(cè)序初步分析興安落葉林外生菌根菌的生態(tài)分布

烏仁陶格斯，王 娟

（呼和浩特民族學(xué)院 環(huán)境工程系，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010051）

外生菌根是真菌的菌絲包被在植物幼嫩細(xì)根外形成的菌套和在細(xì)胞間形成哈帝氏網(wǎng)結(jié)構(gòu)與宿主植物細(xì)根形成的共生體[1-3].Miller（1982）統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，世界上能形成外生菌根的真菌有約5000種[4].我國已經(jīng)報(bào)道的外生菌根菌約520種，隸屬于子囊菌和擔(dān)子菌2個(gè)亞門，41科77屬[5].外生菌根是在北方森林喬木樹種菌根中的主要類型，在森林生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[6].

興安落葉松（Larix gmelinii）是寒溫帶森林主要建群種，也是重要的用材針葉樹種.內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)是我國最重要的國有林區(qū)之一，同時(shí)是我國北疆重要生態(tài)屏障.為加快改善森林生態(tài)環(huán)境，前人對(duì)大興安嶺森林植被與生物多樣性保護(hù)方面做了大量的工作，尤其是在外生菌根菌資源調(diào)查、生態(tài)功能研究方面取得了一定的成果[7].研究表明，落葉松林下土生大型真菌中外生菌根真菌占94.45%[8].樊永軍（2009）報(bào)道了與興安落葉松共生的外生菌根菌14種[9].本文運(yùn)用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，以大興安嶺落葉松為研究對(duì)象，初步調(diào)查分析大興安嶺興安落葉松外生菌根菌生態(tài)分布，為外生菌根菌生態(tài)分布與環(huán)境因子的互作規(guī)律研究提供參考.

1 研究區(qū)概況

內(nèi)蒙古大興安嶺國家級(jí)森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站位于內(nèi)蒙古大興安嶺北部根河林業(yè)局境內(nèi)，地理坐標(biāo)為東經(jīng)121°30′～121°31′，北緯 50°49′～50°51′，海拔 800m～1100m.該區(qū)屬寒溫帶濕潤氣候區(qū).主要森林植被有興安落葉松（Larix gmelinii）為主，伴生種有白樺、山楊、杜鵑等.土壤類型為灰棕壤.

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

于2015年8月，在內(nèi)蒙古大興安嶺國家級(jí)森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站興安落葉松林地，在試驗(yàn)區(qū)內(nèi)選定的5個(gè)樣地、每個(gè)樣地設(shè)3個(gè)采樣點(diǎn)，采集根際0cm～30cm深的土壤樣品，分別取10cm×10cm×10cm帶細(xì)根土樣裝入塑料袋中并編號(hào)，密封，并認(rèn)真填寫好野外調(diào)查表（包括海拔、經(jīng)緯度等）.將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20℃冰箱中保存.將每個(gè)樣地3個(gè)采樣點(diǎn)的土樣進(jìn)行混合，此混合土壤樣品作為DNA提取的樣品，分別編號(hào)為 TX1、TX2、TX3、TX4、TX5.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

土樣總DNA提取 使用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA（具體DNA提取步驟按照說明書進(jìn)行）.

基因組的PCR：

選用引物 真菌ITS檢測(cè)擴(kuò)增引物ITS1和ITS4

PCR 反應(yīng)體系 5×FastPfu Buffer 4μL，2.5 mmol/L dNTPs2μL，F(xiàn)orward Primer(5μmol/L)0.8μL，Reverse Primer(5μmol/L)0.8μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4μL，Template DNA 10ng；補(bǔ)ddH2O至 20μL.

PCR反應(yīng)程序 預(yù)變性95℃ 2min；循環(huán)95℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5min.

PCR實(shí)驗(yàn)鑒定 用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，取2μL上樣量進(jìn)行檢測(cè).

測(cè)序與數(shù)據(jù)處理 將PCR產(chǎn)物利用Ilumina Miseq PE250進(jìn)行測(cè)序.然后根據(jù)測(cè)序結(jié)果，整理、過濾原始數(shù)據(jù)，獲取優(yōu)質(zhì)序列，并進(jìn)行對(duì)比和統(tǒng)計(jì)分析.

3 結(jié)果與分析

鑒定結(jié)果表明，興安落葉松采樣地外生菌根菌分屬于擔(dān)子菌門Basidiomycota和子囊菌門Ascomycota 2個(gè)門，傘菌綱Agaricomycetes、節(jié)擔(dān)菌綱Wallemiomycetes、盤菌綱Pezizomycetes、圓盤菌綱Orbiliomycetes 4個(gè)綱，革菌目Thelephorales、傘菌目 Agaricales、牛肝菌 Boletales、蠟殼耳目Sebacinales、紅菇目 Russulales、阿太菌目 Atheliales、盤菌目Pezizales、圓盤菌目Orbiliales 8個(gè)目.其中傘菌目最多，優(yōu)勢(shì)菌目依次為傘菌目Agaricales、紅菇目Russulales、牛肝菌Boletales. 在科水平上，Thelephoraceae、Sebacinaceae、Pyronemataceae、Inocybaceae、Suillaceae、Cortinariaceae、Russulaceae、Atheliaceae分別占所選真菌總數(shù)的8.14%、5.17%、2.86%、2.73%、1.38%、1.03%、0.72%、0.55%（詳見表1）.

從興安落葉松5個(gè)樣地所采的土壤樣品測(cè)試分析結(jié)果來看（如表1和表2所示），優(yōu)勢(shì)菌屬主要為錦革菌屬Tomentella、絲膜菌屬 Cortinarius、紅菇屬 Russula、乳菇屬（Lactarius）、乳牛肝菌屬 Suillus.在每個(gè)采樣地（TX1、TX2、TX3、TX4和TX5）出現(xiàn)的外生菌根菌種數(shù)依次為34、32、28、26和39種，其中每個(gè)樣地均出現(xiàn)的外生菌根菌種有6種，如Russula versicolor、Russula citrinochlora、Lactarius vietus、Suillus paluster、Suillus spectabilis、Pseudotomentella tristis，TX5樣地出現(xiàn)的菌種最多.

表1 所采樣樣地興安落葉松主要外生菌根真菌科屬水平統(tǒng)計(jì)

表2 鑒定到種的興安落葉松外生菌根菌組成分析

續(xù)表

4 結(jié)論與討論

本文采用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)，對(duì)興安落葉松外生菌根真菌進(jìn)行了較全面的檢測(cè).從結(jié)果分析可知，興安落葉松外生菌根菌類型較多，鑒定到2個(gè)門、4個(gè)綱、8個(gè)目.在科水平上，革菌科、蠟殼耳科、火絲菌科、絲蓋傘科、乳牛肝菌科、絲膜菌科、紅菇科所占比例較高.其中鑒定到種的共有53類型，如絲膜菌屬21種、紅菇屬13種、乳牛肝菌屬5種、棉革菌屬4種、乳菇屬4種、絲蓋傘屬3種、擬棉革菌屬1種、蠟殼耳目屬1種、地孔菌屬1種.從菌根共生關(guān)系來看，這些多種類型的外生菌根菌能夠幫助落葉松的生長及發(fā)育，提高它對(duì)不利環(huán)境的適應(yīng)能力.

研究表明，在森林砍伐區(qū)內(nèi)地上和地下部分的不同外生菌根菌豐度有所區(qū)別[10].外生菌根真菌的分布與溫濕度林下光照、林齡以及撫育間伐等環(huán)境干擾因子有關(guān)[11].目前，外生菌根真菌分布的調(diào)查方法多樣，選擇不同的調(diào)查方法可能會(huì)影響研究結(jié)果.本研究利用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)，18SrRNA基因擴(kuò)增子技術(shù)成功地檢測(cè)了興安落葉松真菌多樣性，通過統(tǒng)計(jì)分析獲得了大量的、較全面的外生菌根真菌信息.本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在興安落葉松不同樣地土壤樣品中的出現(xiàn)的外生菌根菌種類型各不相同，且外生菌根菌鑒定結(jié)果與樊永軍（2009）[9]研究結(jié)果有所差異.說明，興安落葉松林下外生菌根真菌分布較廣，在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性中起到非常重要的作用，但由于所采用的調(diào)查方法、調(diào)查時(shí)間、選擇樣地的不同或環(huán)境干擾因子的影響等多種原因，引起其在土壤樣品中存在種類、數(shù)量的差異.

〔1〕James M,Trappe.A.B.Frank and mycorrhizae：the challenge to evolutionary and ecologic tueory[J].Mycorrhiza,2004,15(14)：277～281.

〔2〕劉潤進(jìn),陳應(yīng)龍編著.菌根學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社,2007.

〔3〕烏仁陶格斯,韓勝利,閆偉.淺析土生空?qǐng)F(tuán)菌(Cenococcum geophilum Fr.)自然侵染率與植被、根際土壤因子的關(guān)系[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(25)：47～51.

〔4〕弓明欽,陳應(yīng)龍,仲崇祿.菌根研究及應(yīng)用[M].北京：中國林業(yè)出版社,1997.

〔5〕馮云利,桑蘭,吳素蕊,等.外生菌根菌研究概況[J].中國食用菌,2013,32(6)：1～3.

〔6〕Pierre-Emmanuel C,Marc B,Abdala G D,et al.The role of ectomycorrhizal communities in forest ecosystem processes：New perspectives and emerging concepts[J].Soil Biology&Biochemistry,2010,42：679～698.

〔7〕韓勝利,張秋良,安慧君,等.興安落葉松天然林空間結(jié)構(gòu)特征分析[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境,2015,29(5)：87～92.

〔8〕祁亮亮.東北地區(qū)落葉松林下大型真菌多樣性研究[D].東北師范大學(xué)，2016.3.

〔9〕樊永軍.內(nèi)蒙古地區(qū)四種樹木外生菌根形態(tài)多樣性及分子鑒定[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.4.

〔10〕Byrd KB,Parker VT,Vogler D et al.The influence of clear-cutting on ectomycorrhizal fungus diversity in a lodgepole pine(Pinus contorta)stand,Yellowstone National Park,Wyoming,and Gallatin National Forest,Montana[J].Canadian Journal of Botany,2000,78(2)：149-156.

〔11〕陳曉,白淑蘭,劉勇,等.撫育間伐對(duì)油松人工林下大型真菌的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2013,33(21)：6935～6943.