外周血中Let-7e、微小RNA-206、微小RNA-605及微小RNA-1236表達與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性研究

李晶，馬宇虹，楊凌

高血壓是心血管疾病及其并發(fā)癥的主要誘因，隨著人們生活水平的提高及環(huán)境變化等因素的影響，高血壓發(fā)病率逐年上升，且呈現(xiàn)低齡化[1]。微小RNAs (miRNAs)是一類進化上高度保守的18～25個核苷酸的單鏈小分子RNA，這類miRNA在動物中廣泛存在，主要通過與靶 mRNA 的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補配對，負調(diào)控轉(zhuǎn)錄后蛋白翻譯表達，參與多種生理病理過程，如細胞分化、增殖、炎癥、免疫反應(yīng)以及心血管病[2-4]。凝集素型氧化低密度脂蛋白受體（lectin-type oxidized LDL receptor 1, LOX-1）作為Let-7e的靶標之一，在高血壓患者中會增加脂蛋白在血管中的滯留時間[5，6]；miRNA-206是肌肉特異表達的小RNA，與血管壁肌肉的發(fā)育有密切的關(guān)系，研究證明miRNA-206可以作為低氧誘導(dǎo)肺動脈高血壓病發(fā)的標志物[7，8]；序列相似家族3成員A（Family with sequence similarity 3 A, FAM3A）作為miRNA-605的靶標之一，控制著PI3K-Akt信號通路，在調(diào)控肝臟葡萄糖和脂類代謝中發(fā)揮著激活的作用[9]；高血壓通常伴有血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的異常表達，血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）作為miRNA-1236的靶標之一，是VEGF通路中重要的節(jié)點，影響心血管疾病的發(fā)展[9]。因此，本研究應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄實時定量法測定與心血管相關(guān)的Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236指標，探討原發(fā)性高血壓與miRNA表達量的關(guān)系，為原發(fā)性高血壓患者治療提供新的治療靶標及思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管科及老年病科2014-07到2016-12收治的169例原發(fā)性高血壓患者（原發(fā)性高血壓組），其中男性81例，女性88例，平均年齡（54.24±11.26）歲；同期選取143例體檢健康者（正常對照組）作為研究對象，其中男性81例，女性62例，平均年齡（52.43±14.26）歲。高血壓的確診標準依據(jù)中國高血壓防治指南（2010年修訂版）[10]，排除繼發(fā)性高血壓患者和免疫系統(tǒng)疾病患者。

1.2 指標測定的材料、試劑及儀器

試劑：TRIzol LS Reagent（Ambion公司，美國）、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo 公司，美國）、Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo公司，美國）、 RNase-free water（北京天根生化技術(shù)公司，中國）、引物由上海生工生物工程有限公司代合成、其它均為國產(chǎn)試劑。儀器：ND-1000型微量紫外分光光度計（Thermo公司，美國）、5430R低溫臺式冷凍離心機（Eppendorf公司，德國）、BG-power5000型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京百晶生物公司，中國）、實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）儀（Bio-rad公司，美國）、普通 PCR 儀(Applied Biosystems公司，美國)。

1.3 研究方法

1.3.1 RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄及定量分析

RNA的提取按照TRIzol?LS Reagent試劑說明書進行，所提取RNA通過微量分光光度計測定濃度。并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量，按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kits說明書進行反轉(zhuǎn)錄，使用莖環(huán)式引物作為反轉(zhuǎn)錄引物。按照Maxima SYBR Green qPCR Master Mix說明書進行實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）測定miRNA表達量，用通用引物U-R和miRNA特異引物分別作為上下游引物，引物退火溫度均為60℃，其他參照說明書，采用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)表達量分析。

1.3.2 引物

以U6作為管家基因，miRbase中提供的miRNA成熟序列設(shè)計莖環(huán)式反轉(zhuǎn)錄引物和實時定量擴增引物。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析方法

用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)用均值±標準差表示。選用分析方法有單因素方差分析（ANOVA LSD），雙變量相關(guān)分析及多因素Logistic回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床基本情況（表2）

表2 兩組患者臨床基本情況及相關(guān)指標的檢測結(jié)果

表2 兩組患者臨床基本情況及相關(guān)指標的檢測結(jié)果

注： miRNA：微小RNA。1 mmHg=0.133 kPa

結(jié)果顯示，年齡、性別和體重指數(shù)，在原發(fā)性高血壓組和正常對照組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而原發(fā)性高血壓組的收縮壓和舒張壓均高于正常對照組（P均＜0.05）。

2.2 miRNA表達方面（表2）

原發(fā)性高血壓組中Let-7e、miRNA-605的表達量均高于正常對照組（P＜0.05）；而原發(fā)性高血壓組中miRNA-206、miRNA-1236的表達量均低于正常對照組（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 相關(guān)性分析（表3）

結(jié)果可見，Let-7e的表達量與收縮壓呈顯著正相關(guān)（r=0.562，P＜0.05）；miRNA-206表達量與收縮壓呈顯著負相關(guān)（r=-0.582，P＜0.05），與舒張壓呈顯著正相關(guān)（r=0.507，P＜0.05）；miRNA-605的表達量與收縮壓呈顯著正相關(guān)（r=0.625，P＜0.05）；miRNA-1236的表達量與舒張壓呈顯著負相關(guān)（r=-0.598，P＜0.05），與體重指數(shù)呈顯著正相關(guān)（r=0.690，P＜0.05）。

2.4 多因素Logistic回歸分析（表4）

結(jié)果顯示，年齡和性別不是原發(fā)性高血壓的的危險因素（P=0.9842），體重指數(shù)的升高，顯著增加患原發(fā)性高血壓的危險（P＜0.01），Let-7e和miRNA-605的表達量的升高，顯著增加患原發(fā)性高血壓的危險（P＜0.05和P＜0.01），而miRNA-206和miRNA-1236的表達量的降低，也顯著增加原發(fā)性高血壓患病的風(fēng)險（P＜0.01和P＜0.01）。

表3 miRNAs表達量與原發(fā)性高血壓相關(guān)性分析

表4 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

高血壓患病率逐年升高[10]，在我國有70%的腦卒中和50%的心肌梗死與高血壓有關(guān)[11]，高血壓已成為我國重大的公共衛(wèi)生問題。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓的發(fā)病是與多種因素有關(guān)[12]。miRNA 是一類由18～25 nt核苷酸組成的非編碼單鏈保守的小分子RNA，其表達具有組織特異性等特點，在細胞分化，生物發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮巨大作用[13]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA與高血壓的發(fā)病機制有關(guān)[14]，目前主要發(fā)現(xiàn)，miR-9、miR-21、miR-18b等可能參與高血壓的發(fā)病機制[15-18]。研究發(fā) 現(xiàn)，Let-7e[14]、miRNA-206[19]、miRNA-605[20]及miRNA-1236[21]可能通過抑制平滑肌增殖，促進血管再生，抗動脈粥樣硬化，抗血栓等作用參與原發(fā)性高血壓的發(fā)病，但是其結(jié)果仍然存在一定爭議，還有待深入研究。

Let-7e被發(fā)現(xiàn)與小鼠的心臟發(fā)育有關(guān)，其靶標叉頭框蛋白1（FOXP1）、T盒轉(zhuǎn)錄因子5（TBX5）、心臟和神經(jīng)嵴衍生物表達蛋白1（HAND1）、蛋白激酶2（AKT2）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活1A（PPARGC1A）等也參與血管的形成[22]；miRNA-206及其靶標神經(jīng)源同源蛋白3（Notch3）、低氧誘導(dǎo)因子1 (HIF-1a)被發(fā)現(xiàn)參與平滑肌細胞增殖與分化[23，24]；miRNA-605及其靶標蛋氨酸合成酶還原酶（MTRR）、SERTA 結(jié)構(gòu)域蛋白 4（SERTAD4）、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥核因子（NPAT）、FAM3A等參與P53通路，與癌癥及細胞凋亡有關(guān)[25]；miRNA-1236及其靶標VEGFR、含7螺旋結(jié)構(gòu)域蛋白（CCDC7）、RAS通路相關(guān)蛋白13（RAB13）、細胞色素P450 4V2（CYP4V2）等與VEGF通路有關(guān)[26]。本研究通過對Let-7e，miRNA-206，miRNA-605及miRNA-1236及其生物學(xué)功能進一步鑒定，確認Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236與原發(fā)性高血壓的發(fā)病具有相關(guān)性。

尿液、外周血等體液中含有循環(huán)miRNA，其可以作為診治疾病的臨床標志物[27，28]。由于循環(huán) miRNA具有易獲取、易研究的特點，逐漸成為疾病標志物研究及發(fā)病機制的熱點，具有一定臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)Let-7e、miRNA-206、miRNA-605 及miRNA-1236可以作為原發(fā)性高血壓診斷的候選標志物，盡管臨床的應(yīng)用還需要更多的樣本做驗證，而且相比于目前的診斷技術(shù)，盡管不是非常方便，但是或許可以用于特殊類型高血壓或者繼發(fā)性高血壓的區(qū)別和鑒定。另外Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及 miRNA-1236可以作為原發(fā)性高血壓治療的候選靶點，通過抑制或增強內(nèi)源miRNA及相關(guān)基因的表達，或者補充外源的miRNA，使其miRNA的表達向期望的方向發(fā)展，進而有助于原發(fā)性高血壓疾病的治療。

高血壓已經(jīng)嚴重危害人類健康的疾病，盡管目前的防控措施已經(jīng)取得顯著效果，但很難治愈。本研究初步證明Let-7e、miRNA-206、miRNA-605及miRNA-1236的表達量與原發(fā)性高血壓的發(fā)病有很大的關(guān)系，其具體調(diào)控機制還有待后續(xù)細胞以及動物實驗的進一步驗證。

[1] Webb AJ, Patel N, Loukogeorgakis S, et al. Acute blood pressure lowering, vasoprotective, and antiplatelet properties of dietary nitrate via bioconversion to nitrite[J]. Hypertension, 2008, 51 (3): 784-790.DOI: 10. 1161/HYPERTENSIONAHA. 107. 103523.

[2] Sessa WC. MicroRNA regulation of cardiovascular functions[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(11): 2369. DOI: 10. 1161/ATVBAHA. 111. 238311.

[3] Cordes KR, SrivastavaD. MicroRNA regulation of cardiovascular development[J]. Circ Res, 2009, 104(3): 724-732. DOI: 10. 1161/CIRCRESAHA. 108. 192872.

[4] Das S, Halushka MK. Extracellular vesicle microRNA transfer in cardiovascular disease[J]. Cardiovasc Pathol, 2015, 24(4): 199-206.DOI: 10. 1016/j. carpath. 2015. 04. 007.

[5] Bao M, Feng X, Zhang Y, et al. Let-7 in Cardiovascular diseases, heart development and cardiovascular differentiation from stem cells[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(11): 23086-23102. DOI: 10. 3390/ijms141123086.

[6] Nakano A, Inoue N, Sato Y, et al. LOX-1 mediates vascular lipid retention under hypertensive state[J]. J Hypertens, 2010, 28(6): 1273-1280. DOI: 10. 1097/HJH. 0b013e32833835d4.

[7] Neves VJ, Fernandes T, Roque FR, et al. Exercise training in hypertension: role of microRNAs[J]. World J Cardiol, 2014, 6: 713-727. DOI: 10. 4330/wjc. v6. i8. 713.

[8] Toivonen JM, Manzano R, Olivan S, et al. MicroRNA-206: a potential circulating biomarker candidate for amyotrophic lateral sclerosis[J].PLoS One, 2014, 9(2): e89065. DOI: 10. 1371/journal. pone. 0089065.

[9] Wang C, Chi Y, Li J, et al. FAM3A activates PI3K p110α/Akt signaling to ameliorate hepatic gluconeogenesis and lipogenesis[J].Hepatology, 2014, 59(5): 1779-1790. DOI: 10. 1002/hep. 26945.

[10] 中國高血壓防治指南修訂委員會. 中國高血壓防治指南2010[J].中華高血壓雜志, 2011, 39(7): 579-616. DOI: 10. 3760/cma. j. issn.0253-3758. 2011. 07. 002

[11] 王文. 2010年修訂版中國高血壓指南與2005年比較的特點分析[J].中華健康管理學(xué)雜志, 2011, 5: 259-262. DOI: 10. 3760/cma. j. issn.1674-0815. 2011. 05. 002.

[12] Calhoun DA, Rd BJ, Oparil S, et al. Refractory hypertension:determination of prevalence, risk factors, and comorbidities in a large,population-based cohort[J]. Hypertension, 2014, 63(3): 451-458. DOI:10. 1161/HYPERTENSIONAHA. 113. 02026.

[13] Nishiguchi T, Imanishi T, Akasaka T. MicroRNAs and cardiovascular diseases[J]. Biomed Res Inter, 2015, 2015: 682857. DOI: 10. 1155/2015/682857.

[14] Li S, Zhu J, Zhang W, et al. Signature microRNA expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection[J]. Circulation, 2011, 124(12): 175-184. DOI: 10. 1161/CIRCULATIONAHA. 110. 012237.

[15] 段練, 熊興江, 王階. MicroRNA與高血壓病[J]. 中國中藥雜志,2014, 39(3): 397-401. DOI: 10. 4268/cjcmm20140308.

[16] Romaine SP, Charchar FJ, Samani NJ, et al. Circulating microRNAs and hypertension-from new insights into blood pressure regulation to biomarkers of cardiovascular risk[J]. Curr Opin Pharmacol, 2016, 27:1-7. DOI: 10. 1016/j. coph. 2015. 12. 002.

[17] Boucherat O, Potus F, Bonnet S. microRNA and pulmonary hypertension[J]. Adv Exp Med Biol, 2015, 888: 237-252. DOI: 10.1007/978-3-319-22671-2_12.

[18] Bátkai S, Thum T. MicroRNAs in hypertension: mechanisms and Therapeutic Targets[J]. Curr Hypertens Rep, 2012, 14(1): 79-87. DOI:10. 1007/s11906-011-0235-6.

[19] Yue J, Guan J, Wang X, et al. MicroRNA-206 is involved in hypoxiainduced pulmonary hypertension through targeting of the HIF-1α/Fhl-1 pathway[J]. Lab Invest, 2013, 93(7): 748-759. DOI: 10. 1038/labinvest. 2013. 63.

[20] Ali SS, Kala C, Abid M, et al. Pathological microRNAs in acute cardiovascular diseases and microRNA therapeutics[J]. J Acute Disease, 2015, 5: 9-16. DOI: 10. 1016/j. joad. 2015. 08. 001.

[21] Cao L, Kong LP, Yu ZB, et al. MicroRNA expression profiling of the developing mouse heart[J]. Int J Mol Med, 2012, 30(5): 1095-1104.DOI: 10. 3892/ijmm. 2012. 1092.

[22] Jalali S, Ramanathan GK, Parthasarathy PT, et al. Mir-206 regulates pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and differentiation[J]. PLoS One, 2012, 7(10): e46808. DOI: 10. 1371/journal. pone. 0046808.

[23] 岳君秋. 大鼠低氧誘導(dǎo)的肺動脈高壓中microRNA-206的表達及其分子機制研究[D]. 湖北武漢: 華中科技大學(xué), 2011.

[24] Zhou CH, Zhang XP, Liu F, et al. Involvement of miR-605 and miR-34a in the DNA damage response promotes apoptosis induction[J].Biophys J, 2014, 106(8): 1792-1800. DOI: 10. 1016/j. bpj. 2014. 02.032.

[25] Jones D, Li Y, He Y, et al. Mirtron microRNA-1236 inhibits VEGFR-3 signaling during inflammatory lymphangiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32(3): 633-642. DOI: 10. 1161/ATVBAHA. 111. 243576.

[26] Sayed ASM, Xia K, Salma U, et al. Diagnosis, prognosis and therapeutic role of circulating miRNAs in cardiovascular diseases[J].Heart Lung Circ, 2014, 23(1): 503-510. DOI: 10. 1016/j. hlc. 2014.01. 001.

[27] Fichtlscherer S, Zeiher AM, Dimmeler S. Circulating microRNAs:biomarkers or mediators of cardiovascular diseases[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2011, 31(11): 2383-2390. DOI: 10. 1161/ATVBAHA. 111. 226696.

[28] Chen F, Yang J, Li Y, et al. Circulating microRNAs as novel biomarkers for heart failure[J]. Hellenic J Cardiol, 2017, pii:S1109-9666(17)30428-1. DOI: 10. 1016/j. hjc. 2017. 10. 002.