雙酶法制備具有促皮膚成纖維細(xì)胞活性的馬鹿茸膠原蛋白肽

楊叢珊，張立鋼，趙玉紅

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）（2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

膠原蛋白作為生物體中的結(jié)構(gòu)蛋白，與細(xì)胞再生、分化、運(yùn)動(dòng)、免疫、關(guān)節(jié)潤滑、血壓抑制、傷口愈合、衰老及疾病等有極其密切的關(guān)系。膠原蛋白肽是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，其特有的三螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，經(jīng)過不同的蛋白酶等降解處理后得到易被人體消化吸收的多肽混合物。相對于膠原蛋白，膠原蛋白肽相對分子量較小，從幾千到幾萬之間分布的很廣，并且呈線性結(jié)構(gòu)，具有很高的消化吸收性[1]。鹿茸中粗蛋白含量占干重的50%以上，膠原蛋白是鹿茸中含量最高的蛋白質(zhì)，鹿茸中膠原類型包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅺ型和Ⅹ型膠原蛋白[2]。提取鹿茸中多肽研究其生物學(xué)活性及藥理作用近年來備受研究者們的關(guān)注[3]，Lei等[4]研究表明從鹿茸中提取的多肽可以作為功能食品或者保健食品中抗炎的一種有效成分。楊吉平等[5]采用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶法制備鹿茸膠原多肽，證明酶解得到的鹿茸膠原多肽相對分子質(zhì)量越小越易被人體消化吸收。Zhao等[6]研究鹿茸多肽sVP32可以激活心肌成纖維細(xì)胞并促進(jìn)膠原合成。徐明等[7]選擇胰蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對鹿茸蛋白水解獲得多肽。Zhang等[8]研究表明天然鹿茸多肽和合成鹿茸多肽都能促進(jìn)軟骨和成骨細(xì)胞增殖并且可以有效改善骨質(zhì)疏松的癥狀。翁梁等[9]采用[3H]TDR深入細(xì)胞DNA法研究表明天然鹿茸多肽是總鹿茸多肽中促進(jìn)表皮細(xì)胞分裂和加速皮膚創(chuàng)傷愈合的主要活性多肽，合成鹿茸多肽對表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

目前有關(guān)膠原蛋白肽對細(xì)胞增殖和創(chuàng)傷愈合方面的研究主要集中在以豬、牛等哺乳動(dòng)物和水產(chǎn)品為原料[10,11]，如Yasutaka等[12]研究魚鱗膠原蛋白水解物對小鼠成纖維細(xì)胞增殖性的影響，證明含有Pro-Hyp的肽對小鼠成纖維細(xì)胞增殖有很大影響進(jìn)而促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合。而有關(guān)對鹿茸膠原蛋白進(jìn)行酶解制備具有促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖效果的膠原蛋白肽的研究尚未見報(bào)道。本研究以馬鹿茸為原料，采用Alcalase和胰蛋白酶進(jìn)行雙酶水解膠原蛋白，研究具有促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖效果的鹿茸膠原蛋白肽的適宜制備條件，為鹿茸膠原蛋白肽在創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鹿茸為三叉茸，來自黑龍江省大莊園集團(tuán)。

胰蛋白酶（250000 U/g），Gibco公司；Alcalase 2.4 L（240000 U/g），丹麥諾維信（中國）公司；正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF），賽齊（上海）生物工程有限公司；α-MEM培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；胰酶消化液、青霉素-鏈霉素溶液、二甲基亞砜（DMSO），Sigma公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、N-N’甲叉雙丙烯酰胺、Tris、三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）、巰基乙醇、TEMED、過硫酸銨（APS）、尿素、甘油、溴酚藍(lán)、鹽酸、HPLC級乙腈、三氟乙酸、考馬斯亮藍(lán)R-250氫氧化鈉、濃硫酸和濃鹽酸等均為國產(chǎn)分析純；超低分子量蛋白質(zhì)Marker，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Hitachi-8900型氨基酸全自動(dòng)分析儀；pH計(jì)EL20，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-8D型電熱恒溫水浴槽，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ELx800NB型酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；DYY-6D型電腦三恒電泳儀，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鹿茸膠原蛋白的粗提取

將鮮馬鹿茸去皮，烘干制成鹿茸粉末，將處理好的鹿茸粉按料液比1:6（g/mL）加入蒸餾水，置于100 ℃沸水中，水煎煮5次，每次2 h，合并上清液，過濾濃縮，棄掉殘?jiān)?，凍干上清液，研磨成粉，備用?/p>

1.3.1.1 馬鹿茸膠原蛋白的吸收波長檢測

對粗提取的馬鹿茸膠原蛋白進(jìn)行波長掃描，選擇波長范圍：190～900 nm。

1.3.1.2 馬鹿茸膠原蛋白氨基酸含量的測定

采用氨基酸分析儀進(jìn)行分析，由農(nóng)業(yè)部谷物及制品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心（哈爾濱）測定。

1.3.2 鹿茸膠原蛋白肽的制備

1.3.2.1 膠原蛋白肽單因素實(shí)驗(yàn)

取膠原蛋白凍干粉置于燒杯中，按底物濃度加入適量水，調(diào)節(jié)至適合pH值，Alcalase在酶底比1～5%，pH 7.0～9.0，溫度45～65 ℃條件下酶解3 h；胰蛋白酶在酶底比1～5%，pH 7.0～9.0，溫度37～48 ℃條件下酶解3 h，分別研究pH值、酶底比和反應(yīng)溫度的影響；根據(jù)兩種酶的單因素實(shí)驗(yàn)，改變兩種酶的反應(yīng)順序，分別測定不同順序的兩種蛋白酶酶解產(chǎn)物的水解度和蛋白質(zhì)回收率和NHDF細(xì)胞增殖率。酶解步驟為在一定條件下向馬鹿茸膠原蛋白溶液中加入第一種蛋白酶進(jìn)行酶解后，沸水浴滅酶，調(diào)節(jié)溫度、pH值后，再加入第二種蛋白酶繼續(xù)酶解，分別測定三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)而確定酶解順序。

1.3.2.2 正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF）培養(yǎng)

NHDF于α-MEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在5%CO2，濕度95%，恒溫37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取96孔板，培養(yǎng)的NHDF細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，按2.5×104/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。待細(xì)胞附著后，各組中分別加入0.2 mg/mL的單因素試驗(yàn)中膠原蛋白降解物5 μL，以加入相同體積PBS緩沖液作為空白對照組。

1.3.2.3 水解度（DH）的測定

采用pH-stat法[13]計(jì)算水解度。

式中，h：單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵的量（mmol/g）；htot：單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中肽鍵的總量(mmol/g)；Ma：所水解蛋白質(zhì)中氨基酸的平均分子量；Pi：組成蛋白質(zhì)的某種氨基酸的百分含量；Mi：組成蛋白質(zhì)的某種氨基酸的分子量。蛋白質(zhì)的氨基酸組成是通過氨基酸分析儀測定，從而計(jì)算出Ma，進(jìn)一步求出htot。

1.3.2.4 多肽得率的測定

對特定底物而言，三氯乙酸可以定性地反應(yīng)蛋白質(zhì)的分解情況，溶解指數(shù)越高，表明較短肽鏈的含量也越高。因此，多肽得率采用三氯乙酸可溶性氮法（TCA-SNI）進(jìn)行檢測，其計(jì)算公式為：

式中：TCA-NSI表示三氯乙酸可溶性氮得率/%；N1表示在10%TCA中可溶性氮量；N0表示原料中總氮量。

采用MTT細(xì)胞計(jì)數(shù)法測定。培養(yǎng)的NHDF細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，按2.5×104/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每個(gè)組分6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，添加各組膠原蛋白降解物繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔分別加入10 μL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，酶標(biāo)儀測量490 nm波長下的吸光值A(chǔ)490。

式中：A1為實(shí)驗(yàn)組吸光值；A0為空白對照組吸光值；A2為對照組吸光值。

1.3.3 馬鹿茸膠原蛋白肽（ACP）分子量的測定

采用SDS-PAGE凝膠電泳的方法進(jìn)行測定，使用濃度為10%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，濃縮膠電壓為70 mV，分離膠電壓為140 mV。染色4 h后用脫色液（甲醇:冰醋酸:水=4.5:4.5:1）脫色，直至背景清晰。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.2制圖，采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)置p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬鹿茸膠原蛋白氨基酸組成

已知膠原蛋白所特有的吸收峰在230 nm左右，與一般蛋白在280 nm處有最大紫外吸收峰的情況不同，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280 nm處有特征性吸收峰，但是膠原蛋白基本沒有色氨酸，酪氨酸的含量也很少[14]。將粗提取的馬鹿茸膠原蛋白進(jìn)行紫外波長掃描，結(jié)果如圖1，在228 nm處有最大吸收峰，結(jié)合表1氨基酸含量分析甘氨酸和脯氨酸含量均較高，因此符合膠原蛋白特性。從表1可知，所提取的馬鹿茸膠原蛋白蛋白含量為68.21%。根據(jù)公式計(jì)算總肽鍵數(shù)為htot=11.30 mmol/g，用于下一步計(jì)算水解度。

為了驗(yàn)證算法對實(shí)際電路產(chǎn)生的波形的適用性，搭建半導(dǎo)體激光發(fā)射和單元雪崩光電二極管(Avalanche Photo Diode，APD)激光接收板級測試平臺，采集實(shí)測不同飽和度的波形在上位機(jī)進(jìn)行運(yùn)算.激光發(fā)射電路產(chǎn)生脈沖寬度為10 ns的1 064 nm激光經(jīng)準(zhǔn)直照射到目標(biāo)物，線性APD接收回波信號產(chǎn)生脈沖電流，經(jīng)過跨阻放大器和模擬放大電路產(chǎn)生脈沖電壓信號，通過控制激光發(fā)射功率和目標(biāo)反射物的距離獲得不同飽和度的波形，由波形采集平臺對飽和度50%～1 000%的實(shí)測波形進(jìn)行采集，在上位機(jī)運(yùn)算.

圖1 馬鹿茸膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of the collagen from antler of red deer

表1 馬鹿茸膠原蛋白氨基酸含量Table 1 Amino acid composition of the collagen from antler of red deer

2.2 單因素酶解條件的確定

2.2.1 酶底比對酶解效果的影響

圖2 Alcalase對酶解反應(yīng)的影響Fig.2 Effects of the enyme-to- collagen ratios on the enzymatic hydrolysis by alcalase

圖3 胰蛋白酶對酶解反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of of the enyme-to- collagen ratios on the enzymatic hydrolysis by trypsin

Alcalase在底物濃度1%，酶底比1～5%，pH 8.0，溫度60 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，胰蛋白酶在底物濃度1%，酶底比1～5%，pH 8.0，溫度45 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，分別考察酶底比對水解度、多肽得率和對正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF）增殖率的影響。

由圖2可知，隨著Alcalase蛋白酶酶底比的增加，水解度明顯增加，在酶底比達(dá)2%之后趨于穩(wěn)定；多肽得率和細(xì)胞增殖率在酶底比2%之后略有下降；可能是當(dāng)酶的濃度低于底物濃度時(shí)，酶用量增大加快反應(yīng)速度，堿性蛋白酶酶底比在2%時(shí)水解度為14.28%，多肽得率為60.5%，細(xì)胞增殖率為16.88%。由圖3可知，隨著胰蛋白酶酶底比的增加，水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率呈現(xiàn)逐漸上升后趨于穩(wěn)定的趨勢，胰蛋白酶酶底比為5%時(shí)效果最好，水解度為8.58%，多肽得率為60.52%，細(xì)胞增殖率為13.44%。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果與許丹[15]在制備魷魚皮膠原蛋白肽時(shí)綜合考慮堿性蛋白酶和胰蛋白酶的酶解效果和用量相似，可能是當(dāng)添加酶的濃度相對于底物濃度較高時(shí)，反應(yīng)速率開始由底物決定，所以繼續(xù)增加酶的用量水解度增加緩慢。

2.2.2 pH對酶解效果的影響

圖4 Alcalase對酶解反應(yīng)的影響Fig.4 Effects of the pH on the enzymatic hydrolysis by alcalase

圖5 胰蛋白酶對酶解反應(yīng)的影響Fig.5 Effects of the pH on the enzymatic hydrolysis by trypsin

Alcalase在底物濃度1%，酶底比2%，pH 7.5～9.5，溫度60 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，胰蛋白酶在底物濃度1%，酶底比5%，pH 7.0～9.0，溫度45 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，分別考察pH對水解度、多肽得率和對正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF）增殖率的影響。

由圖4可知，在Alcalase蛋白酶酶解過程中，隨著pH增加，水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，這是由于溶液pH不同會影響蛋白酶的活力，在pH 9時(shí)達(dá)到最大值，水解度為20.31%，多肽得率為83.42%，細(xì)胞增殖率為18.83%，這與陳季旺[16]等采用堿性蛋白酶水解魚蛋白制備魚肽的結(jié)果相似，在pH 8.0～9.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，水解度明顯增加，當(dāng)pH 9.5時(shí)，水解度開始下降；王長周[17]選用堿性蛋白酶制備林蛙皮膠原蛋白肽，其確定最佳酶解條件pH 9.0時(shí)水解度最好，蛙皮轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%以上；由圖5可知，在胰蛋白酶酶解過程中，隨著pH的增加，水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，這是由于胰蛋白酶是一種中性偏堿性的酶，因此在偏堿性的條件下酶解效果最好。在pH 8.0時(shí)達(dá)到最大值，水解度為8.58%，多肽得率為60.2%，細(xì)胞增殖率為13.93%，這與劉程惠[18]等采用胰蛋白酶水解制備海參肽的結(jié)果相似，其肽得率在pH為8.0時(shí)達(dá)到最大值，其酶解效果最好，pH繼續(xù)升高，肽得率反而下降。

2.2.3 溫度對酶解效果的影響

圖6 Alcalase對酶解反應(yīng)的影響Fig.6 Effects of the temperature on the enzymatic hydrolysis by alcalase

圖7 胰蛋白酶對酶解反應(yīng)的影響Fig.7 Effects of the temperature on the enzymatic hydrolysis by trypsin

Alcalase在底物濃度1%，酶底比2%，pH 9.0，溫度45～65 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，胰蛋白酶在底物濃度1%，酶底比5%，pH 8.0，溫度37～48 ℃，時(shí)間3 h條件下酶解，分別溫度對水解度、多肽得率和對正常人皮膚成纖維細(xì)胞（NHDF）增殖率的影響。

由圖6和圖7可知，Alcalase蛋白酶和胰蛋白酶酶解過程中，隨著溫度升高，水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這是因?yàn)闇囟鹊纳呖梢约涌烀复俜磻?yīng)，而當(dāng)溫度上升到一定程度時(shí)又會增加蛋白酶的變性速度。圖6中Alcalase蛋白酶作用時(shí)，在60 ℃酶解效果最好，水解度為20.31%，多肽得率為83.42%，細(xì)胞增殖率為18.83%，這與潘麗軍[19]等采用堿性蛋白酶制備谷氨酰胺活性肽相似，在溫度60 ℃時(shí)，水解度最大；李巖[20]等采用堿性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶雙酶水解從豬皮膠原蛋白制備寡肽水解物，其中酶解溫度在60 ℃時(shí)，水解度最高，達(dá)到17.7%。圖7中胰蛋白酶作用時(shí)，在45 ℃酶解效果最好，水解度為8.58%，多肽得率為60.2%，細(xì)胞增殖率為13.93%，這與李誠[22]等選用胰蛋白酶對豬血紅蛋白酶解制備降血壓肽得到的最佳酶解條件相似，在溫度為40～45 ℃間達(dá)到峰值，40～45 ℃為最適宜溫度。當(dāng)溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，水解度大幅度下降；Zhuang[21]等選取胰蛋白酶在45 ℃條件下制備水母膠原蛋白肽，所得水解度最高。

2.3 酶解順序的確定

圖8 加酶順序?qū)β谷啄z原蛋白酶解反應(yīng)的影響Fig.8 Effects of the added sequence of two enzymes on the enzymatic hydrolysis of collagen from antler of red deer

根據(jù)兩種蛋白酶的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別進(jìn)行水解，并改變兩種酶的作用順序，考察酶解順序?qū)γ附庑Ч挠绊?，結(jié)果見圖8。為進(jìn)一步提高水解度，使鹿茸膠原蛋白充分水解，提高小分子肽類物質(zhì)的含量，本研究采用Alcalase蛋白酶和胰蛋白酶分步水解法，在合適的條件下將馬鹿茸膠原蛋白水解。雙酶分步水解不同于單酶，第一種酶的水解產(chǎn)物將是第二種酶的底物，同時(shí)蛋白酶本身也是蛋白質(zhì)，它們之間會互為底物，交叉影響，本研究在第一種酶水解結(jié)束后進(jìn)行滅酶，以消除其影響。分別以兩種酶各自的水解條件，對鹿茸膠原蛋白進(jìn)行雙酶分步水解，以水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，考察加酶順序?qū)ζ溆绊?。由圖8可知，先加入Alcalase蛋白酶后加入胰蛋白酶的水解方式其水解度、多肽得率、細(xì)胞增殖率均高于先加入胰蛋白酶后加入Alcalase蛋白酶的酶解情況，四種酶解方法之間對水解度的影響差異較顯著（p<0.05），其中水解度：AL-TR>TR-AL>Alcalase>胰蛋白酶；四種酶解方法之間對多肽得率的影響差異較不顯著（p<0.05），其中多肽得率：AL-TR>TR-AL>Alcalase>胰蛋白酶；四種酶解方法之間對細(xì)胞增殖率的影響顯著（p<0.05），其中細(xì)胞增殖率：AL-TR>Alcalase>TR-AL>胰蛋白酶。所以適宜水解方法是先采用Alcalase酶解后采用胰蛋白酶酶解。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of orthogonal experiment

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇L（36）正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。選取Alcalase酶底比（A）1%、2%、3%，Alcalase酶解pH（B）8.5、9.0、9.5，Alcalase酶解溫度（C）55 ℃、60 ℃、65 ℃，胰蛋白酶酶底比（D）4%、5%、6%，胰蛋白酶酶解pH（E）7.5、8.0、8.5，胰蛋白酶酶解溫度（F）42 ℃、45 ℃、48 ℃。按照上述單因素方法測定水解度、多肽得率和細(xì)胞增殖率，結(jié)果見表2：由極差分析結(jié)果可知，以水解度為指標(biāo)的因素影響度依次為：B、A、C、D、F、E，最佳組合為A2B3C2D3E3F1；以多肽得率為指標(biāo)的因素影響程度依次是：B、A、C、F、E、D，最佳組合為A2B3C2D3E3F1；以NHDF細(xì)胞增殖率為指標(biāo)的因素影響程度依次是：A、B、D、C、F、E，最佳組合為A2B2C2D3E2F1。三個(gè)指標(biāo)單獨(dú)分析出來的最佳組合不一致，所以需要根據(jù)因素對三個(gè)指標(biāo)的影響程度綜合考慮，確定適宜工藝條件。Alcalase酶解中pH對三種指標(biāo)都是影響較大的因素，因此選擇pH 9.0，其酶底比對三種指標(biāo)的影響程度也在第一位和第二位，對于水解度和多肽得率而言，取A2和A3影響程度不大（p<0.05），并且對三種指標(biāo)的影響都是A2為優(yōu)，所以選擇酶底比為2%，而從細(xì)胞增殖率來看，取B2效果較好，所以選擇Alcalase酶底比2%；Alcalase酶解溫度對三種指標(biāo)的影響都是C2最好，所以選擇60 ℃。胰蛋白酶酶解pH對水解度和多肽得率有一定的影響，但是細(xì)胞增殖率作為三者中一個(gè)重要的指標(biāo)應(yīng)優(yōu)先考慮，所以選擇pH 8.0；胰蛋白酶酶底比和酶解時(shí)間對酶解效果好的最優(yōu)條件一致，分別選擇D3和F1，所以本實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件為A2B2C2D3E2F1，即先用Alcalase于酶底比2%、pH 9.0、溫度60 ℃條件下酶解3 h，再用胰蛋白酶于酶底比6%，pH 8.0溫度42 ℃條件下酶解3 h。在此最佳條件下，水解度為21.7%，多肽得率是86%，細(xì)胞增殖率為22.75%。

2.5 馬鹿茸膠原蛋白肽分子量分布結(jié)果

圖9 電泳圖Fig.9 Electrophoretogram

將提取的馬鹿茸膠原蛋白和馬鹿茸膠原蛋白肽分別測定分子量分布情況，如圖9。

根據(jù)電泳圖可知，馬鹿茸膠原蛋白的分子量在100 ku左右，屬于大分子物質(zhì)，并且分子量分布大小范圍較窄，說明馬鹿茸膠原蛋白保持完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)；而馬鹿茸膠原蛋白肽基本分布在5 ku以下，說明馬鹿茸膠原蛋白已被酶解為小分子物質(zhì)。

2.6 細(xì)胞形態(tài)觀察

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化后最適條件制備的馬鹿茸膠原蛋白肽進(jìn)行NHDF細(xì)胞培養(yǎng)48 h，將不添加馬鹿茸膠原蛋白肽設(shè)為空白對照組，觀察細(xì)胞形態(tài)。

如圖10可以看出，培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下空白組中有一部分沒有伸展的圓形細(xì)胞，并且細(xì)胞數(shù)量較少；而添加了馬鹿茸膠原蛋白肽培養(yǎng)的NHDF細(xì)胞大多呈長梭形、部分呈三角形，可以觀察到細(xì)胞數(shù)量明顯增多并且細(xì)胞狀態(tài)良好。因此，結(jié)合以上數(shù)據(jù)，馬鹿茸膠原蛋白肽可以促使人皮膚成纖維細(xì)胞增殖。

圖10 倒置顯微鏡下觀察NHDF細(xì)胞培養(yǎng)48 h形態(tài)Fig.10 Morphology of fibroblasts observed under inverted microscope

3 結(jié)論

Alcalase蛋白酶和胰蛋白酶雙酶分步水解可以制備促使人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的馬鹿茸膠原蛋白肽，二者作用順序影響酶解效果，適宜的制備條件為：先用Alcalase蛋白酶在底物濃度1%，酶底比2%，pH 9.0，溫度60 ℃條件下酶解3 h；再用胰蛋白酶在底物濃度1%，酶底比6%，pH 8.0，溫度42 ℃條件下酶解3 h，最終水解度為21.7%，多肽得率是86%，細(xì)胞增殖率可達(dá)到22.75%。

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