免疫親和高效液相色譜法測(cè)定小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法改進(jìn)

何攀，閆冬閣，陳渠玲，李棗棗

（1.中南糧油食品科學(xué)研究院有限公司，湖南長(zhǎng)沙 410000）（2.湖南糧食集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南長(zhǎng)沙 410000）

小麥?zhǔn)侨蚍N植面積最大、總產(chǎn)量最高、也是最為重要的糧食作物，超過(guò)1/3的世界人口以小麥制品為主食。在中國(guó)，小麥僅次于第一大糧食作物水稻，總產(chǎn)量1.2億噸左右，是中國(guó)半數(shù)以上人口的主糧[1]。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol），簡(jiǎn)寫(xiě)“DON”，又稱嘔吐毒素，屬于單端孢霉烯族化合物，主要是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌和雪腐鐮刀菌等真菌產(chǎn)生的次級(jí)有毒代謝物[2,3]，是小麥等谷物中最為普遍發(fā)生的鐮刀菌毒素[4]，DON的污染程度與降水、花期濕度和儲(chǔ)藏條件密切相關(guān)[5]，世界各地均有關(guān)于該毒素的污染報(bào)道[6～9]，是世界上分布最廣、污染最嚴(yán)重的霉菌毒素之一[10～14]。DON可以干擾核糖體肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，阻礙核糖體循環(huán)，抑制蛋白質(zhì)的合成，導(dǎo)致頭疼、頭暈、嘔吐、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、免疫功能障礙和繁殖功能障礙等癥狀[15～17]。

DON的污染對(duì)于小麥粉的儲(chǔ)藏和食用安全的危害非常大，因此建立準(zhǔn)確有效的DON檢測(cè)方法尤為重要。液相色譜是目前檢測(cè)小麥及其制品中DON最普遍使用的方法，今年更新的GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》中的免疫親和高效液相色譜法的色譜條件對(duì)于檢測(cè)小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測(cè)存在出現(xiàn)假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，而第一法同位素液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，雖然干擾小但是檢測(cè)成本高，儀器價(jià)格昂貴。關(guān)于液相色譜檢測(cè)DON的方法研究文獻(xiàn)還有很多，如羅穎鵬等[18]建立了固相萃取-高效液相色譜對(duì)小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進(jìn)行測(cè)定方法，研究?jī)?yōu)化了提取劑、凈化方法、流動(dòng)相組成及流速等條件，其優(yōu)化后的色譜條件為流動(dòng)相乙腈-水（6:95，V/V），流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，DON檢測(cè)結(jié)果良好，回收率達(dá)到90.12%～106.25%；陸源等[19]建立了免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測(cè)小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的分析方法，主要研究的是通過(guò)優(yōu)化前處理方法，消除標(biāo)準(zhǔn)品中乙酸乙酯引起的溶劑效應(yīng)，其測(cè)試的色譜條件為流動(dòng)相甲醇-水（20:80，V/V），流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；吳振興等[20]建立小麥和玉米中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與雪腐鐮刀菌烯醇的免疫親和凈化-高效液相色譜檢測(cè)方法，對(duì)色譜條件、提取液和凈化柱的選擇進(jìn)行了優(yōu)化研究，其優(yōu)化后的色譜條件為流動(dòng)相：10%乙腈水，流速：0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm；張羽等[21]主要研究了免疫親和層析凈化高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫吸附法的方法比較，其液相色譜條件為流動(dòng)相甲醇-水（20:80，V/V），流速0.7 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm，結(jié)果表明兩種方法無(wú)顯著性差異；金海濤等[22]建立了快速檢測(cè)小麥中DON、ZON、T-2的高效液相色譜質(zhì)譜方法，該方法能夠一次快速檢測(cè)小麥粉中3種毒素，具有速度快、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，其中三重四級(jí)桿的的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式采集離子對(duì)，本身就具有輔助定性的功能，達(dá)到了定量檢測(cè)DON的同時(shí)定性的目的。這些研究成果中的液相色譜法，均是設(shè)置紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為218 nm來(lái)檢測(cè)樣品，未有通過(guò)改變檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)優(yōu)化色譜條件的研究，除液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用能利用離子對(duì)進(jìn)行輔助定性分析外，其他方法均未有對(duì)DON檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定性分析的研究報(bào)道。

本文研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于在優(yōu)化色譜分離條件的同時(shí)，通過(guò)改變紫外檢測(cè)波長(zhǎng)來(lái)降低雜質(zhì)信號(hào)干擾，并利用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，收集色譜結(jié)果為陽(yáng)性的紫外吸收光譜，通過(guò)與建立的DON標(biāo)準(zhǔn)光譜普庫(kù)進(jìn)行匹配性檢索的定性結(jié)果判斷，能有效避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度，避免了假陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

小麥粉：市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；DON免疫親和柱（柱容量1 mg，柱體積5 mL）：北京中檢維康生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純）：國(guó)藥集團(tuán)；超純水（18.25 MΩ）：中沃水務(wù)純水機(jī)；脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，1 mL，批號(hào)CDGG-014445-06）：o2si公司；其他必要分析純?cè)噭┚?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

安捷倫1260型高效液相色譜儀：配二極管陣列檢測(cè)器；FA1104N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；MD200-1型氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司；TGL16G型高速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；HY-2調(diào)速多用振蕩器：金壇市恒豐儀器制造有限公司；ZWM-LSI-20型超純水機(jī)：中沃水務(wù)；W-SPE 24型固相萃取儀：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；玻璃纖維濾紙：直徑11 cm，孔徑1.5 μm；水相微孔濾膜：0.45 μm；聚丙烯刻度離心管：具塞，50 mL；玻璃注射器：10 mL。

1.2 方法

1.2.1 DON標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確移取適量DON標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液用初始流動(dòng)相稀釋，配制成50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1000 ng/mL、2000 ng/mL和5000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.2.2 樣品預(yù)處理

樣品提?。悍Q取5.00 g小麥粉于50 mL離心管中加1 g聚乙二醇，加水20 mL，混勻，置于多功能振蕩器中振蕩20 min。5000 r/min下離心5 min，用玻璃濾紙過(guò)濾，收集濾液進(jìn)行凈化處理。

樣品的凈化、洗脫和濃縮：將2.00 mL樣品濾液以每秒1滴的速度通過(guò)已恢復(fù)常溫的DON免疫親和柱，并分別用5 mL PBS緩沖鹽溶液（pH=7.4）和5 mL水先后淋洗免疫親和柱，控制流速為每秒1滴～2滴，直至空氣進(jìn)入親和柱中，棄去全部流出液，抽干小柱，準(zhǔn)確加入2.0 mL甲醇洗脫親和柱，控制每秒1滴的速度，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮?dú)饩従彽貙⑾疵撘捍抵两桑尤?.0 mL初始流動(dòng)相，渦旋30 s溶解殘留物，0.45 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse PAH-C18（柱長(zhǎng)150 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；流動(dòng)相：甲醇+水（25+75）；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：50 μL；二極管陣列檢測(cè)器：波長(zhǎng)240 nm，狹縫寬4 nm，波長(zhǎng)掃描范圍190 nm～400 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動(dòng)相甲醇與水比率優(yōu)化

圖1 不同流動(dòng)相組成的DON樣品色譜圖Fig.1 Chromatograms of DON with different mobile phases

流動(dòng)相甲醇與水的比率對(duì)DON與樣品雜質(zhì)的的分離度的影響很大，在波長(zhǎng)設(shè)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的218 nm的時(shí)候，本文研究了不同比率的甲醇與水對(duì)樣品分離度的影響，結(jié)果如下圖1所示，隨著流動(dòng)相中甲醇比率增加，DON出峰越早，DON與雜質(zhì)的分離度也隨之變化，當(dāng)甲醇-水（25:75，V/V）的時(shí)候，DON的分離度最好。如果按照國(guó)標(biāo)規(guī)定的甲醇-水（15:75，V/V），目標(biāo)峰DON與大雜質(zhì)峰幾乎完全重合，極易將樣品判定為假陽(yáng)性的結(jié)果。大雜質(zhì)峰可能是與DON分子結(jié)構(gòu)相近的的能被免疫親和柱保留并洗脫的物質(zhì)。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化

雖然對(duì)流動(dòng)相甲醇與水的比率進(jìn)行了優(yōu)化，將DON與雜質(zhì)峰分離出來(lái)了，但是大的雜質(zhì)峰依然對(duì)DON目標(biāo)峰存在一定干擾，由圖1可知，雜質(zhì)峰緊挨著DON目標(biāo)峰出峰，并且信號(hào)比目標(biāo)峰強(qiáng)很多，為了排除雜質(zhì)峰可能對(duì)DON目標(biāo)峰檢測(cè)存在的干擾，本文通過(guò)研究干擾雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰的紫外吸收波長(zhǎng)，重新設(shè)計(jì)了檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果如下圖2所示，從圖中結(jié)果可以看出，當(dāng)波長(zhǎng)為218 nm的時(shí)候，DON有最大吸收峰，但同時(shí)雜質(zhì)的吸收信號(hào)也很強(qiáng)，但是當(dāng)波長(zhǎng)為240 nm的時(shí)候，雜質(zhì)峰的吸收信號(hào)下降83%，而DON的吸收峰，信號(hào)只下降了38%，本文通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)波長(zhǎng)設(shè)置，可以顯著降低雜質(zhì)峰的信號(hào)，并且還能保證DON目標(biāo)物的檢出限，其檢出限能達(dá)到20 μg/kg，低于國(guó)標(biāo)規(guī)定的100 μg/kg，這部分將在2.4的方法驗(yàn)證中再討論，通過(guò)波長(zhǎng)設(shè)置，在顯著降低干擾信號(hào)的同時(shí)，很好地保留DON目標(biāo)物的檢出限，所以本文在檢測(cè)小麥粉中DON的時(shí)候檢測(cè)波長(zhǎng)應(yīng)該設(shè)置為240 nm。波長(zhǎng)設(shè)置為218 nm與240 nm的對(duì)比圖如下圖3所示，由圖3可知，雜質(zhì)峰信號(hào)下降明顯，對(duì)DON峰檢測(cè)的干擾也會(huì)小很多。

圖2 DON紫外吸收?qǐng)D譜與干擾峰紫外吸收?qǐng)D譜峰的比較Fig.2 Comparison of ultraviolet absorption spectra of DON and interference peaks

圖3 波長(zhǎng)設(shè)置為218 nm與240 nm的樣品色譜的比較Fig.3 Comparison of sample chromatography with the wavelength of 218 nm, 240 nm

2.3 二極管陣列檢測(cè)器定性確證排除假陽(yáng)性

在國(guó)標(biāo)GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測(cè)定》中第一法為同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（2017年6月23號(hào)實(shí)施），此法雖然能有效避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，提高樣品檢測(cè)準(zhǔn)確度，但是儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本高昂，對(duì)檢驗(yàn)員技術(shù)能力要求很高，不是一般實(shí)驗(yàn)室所能配備和使用。

本文通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器可對(duì)色譜峰每個(gè)時(shí)刻進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描的功能，研究了DON的定性檢測(cè)方法。建立了DON的標(biāo)準(zhǔn)紫外吸收光譜普庫(kù)，標(biāo)樣色譜圖與樣品色譜測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖與樣品色譜圖的比較Fig.4 Chromatograms of standard and sample

圖5 DON的標(biāo)準(zhǔn)紫外吸收?qǐng)D譜Fig.5 UV absorption spectrum of DON Standard

圖6 光譜檢索結(jié)果圖Fig.6 Spectral retrieval results

從標(biāo)樣色譜圖中提取DON在190 nm～400 nm的光譜圖結(jié)果見(jiàn)圖5，通過(guò)建立的DON標(biāo)準(zhǔn)紫外吸收普庫(kù)與從樣品色譜圖中提取的的DON目標(biāo)峰及干擾雜質(zhì)峰的光譜圖進(jìn)行檢索得到的結(jié)果如圖6。

從圖6的結(jié)果可以明顯看出，干擾雜質(zhì)峰的光譜與普庫(kù)光譜比較光譜偏差很大，匹配度通過(guò)色譜軟件計(jì)算只有34.4%非常低，而DON目標(biāo)峰的光譜與普庫(kù)光譜比較光譜偏差非常小，匹配度通過(guò)色譜處理軟件計(jì)算能達(dá)到99.7%。

通過(guò)設(shè)置光譜匹配度達(dá)到95%以上可確證為DON的方法進(jìn)行輔助的定性分析能有效避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，提高了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度，與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜相比能節(jié)省大量檢測(cè)成本。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

以25%的甲醇溶液配制DON的梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以所得峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制回歸方程為：Y=0.04084X-0.0506，相關(guān)系數(shù)：0.99989，線性范圍50 ng/mL～5000 ng/mL，結(jié)果如圖7所示線性關(guān)系良好。

2.4.2 回收率與精密度

取未被DON污染的小麥粉樣品進(jìn)行三水平加標(biāo)試驗(yàn)，加標(biāo)后樣品中DON濃度分別為50 μg/kg、2000 μg/kg和500 μg/kg，按照樣品前處理方法進(jìn)行上機(jī)測(cè)試，每個(gè)加標(biāo)樣平行測(cè)試6次，計(jì)算回收率和精密度，其結(jié)果見(jiàn)表1。其樣品加標(biāo)的回收率在91.7%～97.2%，精密度（relative standard deviation，RSD）0.83%～3.21%，具有較高的回收率和較低的RSD值。

2.4.3 檢出限與定量限

圖7 回歸曲線Fig.7 Regression curve

取未被DON污染的小麥粉樣品加標(biāo)成3倍信噪比信號(hào)的濃度樣品和10倍信噪比濃度的樣品進(jìn)行測(cè)試，測(cè)得檢出限為20 μg/kg，定量限為66.7 μg/kg。

表1 回收率與精密度Table 1 Recovery and precision

3 結(jié)論

本文研究了2017年6月23號(hào)實(shí)施的GB 5009.111-2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏臏y(cè)定》中第二法的免疫親高效液相色譜法，優(yōu)化了其色譜條件，結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-水（25:75，V/V），DON與樣品測(cè)試液中雜質(zhì)有最好的分離度，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為240 nm時(shí)，在保證DON檢測(cè)靈敏度的同時(shí)顯著降低了干擾雜質(zhì)峰的信號(hào)，降低了假陽(yáng)性誤判的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行了方法驗(yàn)證試驗(yàn)，達(dá)到了良好的線性范圍、較低的檢出限、較高的回收率和檢測(cè)精密度，并且本文還研究了二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)DON的定性分析方法，即通過(guò)設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)掃描范圍為190 nm～400 nm，提取標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖中的目標(biāo)峰光譜圖，建立了DON的紫外吸收?qǐng)D譜普庫(kù)，通過(guò)提取樣品色譜圖中目標(biāo)峰的光譜圖，對(duì)檢出的目標(biāo)色譜峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)普庫(kù)檢索，彌補(bǔ)了之前對(duì)于液相色譜檢測(cè)DON的定性分析的不足，達(dá)到了定性確證的目的，更加有效避免了假陽(yáng)性的誤判。

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