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    基于NanoLC-Orbitrap技術(shù)測定六種不同栽培品種大豆中多肽Lunasin含量

    2018-03-01 02:37:07高夢笛孟獻(xiàn)斌幸岑璨張玥鄧海騰王鳳忠
    現(xiàn)代食品科技 2018年1期
    關(guān)鍵詞:中黃多肽液相

    高夢笛,孟獻(xiàn)斌,幸岑璨,張玥,鄧海騰,王鳳忠

    (1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)(2.清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)檢測中心,北京 100084)

    大豆(Glycine max( L ). Merr)是我國四大油料作物之一,具有非常高的營養(yǎng)價值。大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)和多肽,其中露那辛(Lunasin)是最早由日本新瀉大學(xué)醫(yī)學(xué)部的研究小組從大豆中分離純化并鑒定出來的一種功能多肽,分子質(zhì)量為5.5 ku,由43個氨基酸組成,氨基酸序列為SKWQHQQDSCRKQLQ GVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD[1]。2005年Lunasin被美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校de Lumen研究小組成功克隆,發(fā)現(xiàn)Lunasin能破壞細(xì)胞有絲分裂并引起染色體破裂和細(xì)胞凋亡,具有抗腫瘤的功效[2]。2012年,Gakvez等[3]在肝臟細(xì)胞HepG2中發(fā)現(xiàn)Lunasin可能通過降低HMGCR的活性來降低膽固醇。

    研究表明Lunasin具抗氧化、抗炎、抗癌及降低膽固醇等功效,被預(yù)測可作為預(yù)防癌癥和降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的藥物。由于Lunasin來源于天然植物大豆,安全性相對較高,幾乎沒有毒副作用且不良反應(yīng)少,使其可能成為保護(hù)心血管方面的一線藥物。

    目前報(bào)道的對Lunasin的定量分析常采用依賴于抗體的方法,Jeong等[4,5]用Western Blot法研究了美國市售的部分大豆產(chǎn)品,包括脫脂豆奶粉、大豆分離蛋白Lunasin的含量;Gonzalez等[6]用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)研究發(fā)現(xiàn)美國產(chǎn)不同種大豆中Lunasin的含量不同,Ren等[7]用LC-MS的方法檢測了藜麥中含有Lunasin。Western Blot和ELISA檢測依賴于Lunasin抗體的特異性,若抗體將具有相同抗原決定簇的其它肽類誤認(rèn)為是Lunasin,則可能干擾測定結(jié)果。只采用傳統(tǒng)LC-MS測定Lunasin,樣品中的復(fù)雜基質(zhì)干擾嚴(yán)重目標(biāo)肽響應(yīng)較低[7],影響質(zhì)譜測定的閾值、線性、準(zhǔn)確度,甚至?xí)霈F(xiàn)假陽性[8,9]。本研究嘗試采用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜Orbitrap Fusion系統(tǒng)來進(jìn)行檢測,該儀器可實(shí)現(xiàn)三種質(zhì)量分析器的共同協(xié)作,平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)實(shí)現(xiàn)了對全部離子碎片的檢測,該方法可以顯著提高識別的多肽數(shù)量,能夠更好地排除背景干擾和假陽性。

    我國大豆資源豐富、產(chǎn)區(qū)眾多,品種逾越千個,主要有三大大豆主產(chǎn)區(qū)[10,11]。黑河43大豆是東北春大豆區(qū)主栽大豆品種;黔豆7號大豆是云貴高原春夏大豆區(qū)主栽大豆品種,是適宜西南山區(qū)種植的豐產(chǎn)性好、穩(wěn)產(chǎn)性強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)品種;徐豆14大豆、皖豆35大豆是黃淮海夏大豆區(qū)的主栽品種,具有高產(chǎn)、籽粒商品性優(yōu)良等特點(diǎn);中黃系列大豆是近年來我國大面積推廣栽培的品種之一,由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育且具有高蛋白、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[12,13]。美國和韓國等國外大豆品種中的Lunasin含量多有研究,而國產(chǎn)大豆品種中Lunasin含量鮮有報(bào)道。因此有必要建立有效的方法通過不同品種的比較篩選出富含多肽Lunasin的最佳品種,為功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。

    本研究以六種國產(chǎn)大豆:中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆為實(shí)驗(yàn)材料,建立了分離提取并測定大豆多肽Lunasin的方法,采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離降低了基質(zhì)干擾,用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap)平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)對六種國產(chǎn)大豆中Lunasin含量進(jìn)行測定,本測定方法準(zhǔn)確可靠,重現(xiàn)性好。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 樣品

    黑河43大豆由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所提供;徐豆14大豆由徐州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供;黔豆7號大豆由貴州省油料研究所提供;中黃13大豆、中黃75大豆由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

    1.1.2 試劑

    乙醇(色譜純)、乙腈(色譜純)、甲酸(色譜純)、三氟乙酸,美國賽默飛世爾科技公司;質(zhì)譜級碳酸氫氨,美國Sigma公司;質(zhì)譜級二硫蘇糖醇(DTT),美國Sigma公司;胰蛋白酶(Trypsin),美國Promega公司;Mini-PROTEAN? TGX?預(yù)制膠,美國Bio-Rad公司;Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品,成都凱捷生物醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;Blue Plus? IV預(yù)染Protein Marker,北京全式金生物技術(shù)有限公司。

    1.1.3 主要儀器設(shè)備

    電子天平Y(jié)Q116-01,梅特勒-托利多公司;超速多功能粉碎機(jī),浙江永康公司;恒溫培養(yǎng)振蕩器,上海智城分析儀器制造公司;離心機(jī)(LYNX6000),美國賽默飛世爾科技公司;ZLS-1真空離心濃縮儀,湖南赫西儀器裝備有限公司;電泳儀(JY600C),北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;EASY-Spray column(50 μm×15 cm,2 μm)色譜柱,美國賽默飛世爾科技公司;納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion Tribrid),美國賽默飛世爾科技公司;配制試劑所用的水為經(jīng)美國密里博公司的Milli-QAdvantage超純水儀處理過的超純水。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 Lunasin的提取

    Lunasin的提取:將六種大豆粉碎過60目篩,參考Krishnan等[14]人的提取方法并稍作改動,稱量中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆,各100 mg,每份分別加入1 mL超純水,1 mL 30%的乙醇。在37 ℃震蕩提取30 min,于4 ℃ 12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,收集上層清液。取上層清液加入20 μL 100 mM氯化鈣,混勻,靜置5 min,于4 ℃ 12000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min,棄去上層清液,取下層風(fēng)干。

    十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離(SDS-PAGE):將上述樣品用1ml 1X SDS loading buffer溶解后離心,取上清液移至干凈的EP管中,煮沸5 min,上樣量5 μL,用Bio-rad預(yù)制膠和垂直電泳槽,恒定電壓80 V電泳120 min,考馬斯亮藍(lán)染色后脫色。

    切下對應(yīng)凝膠條帶,進(jìn)一步切碎成1 mm3小塊,轉(zhuǎn)移于EP管中,用乙腈和碳酸氫氨脫色,二硫蘇糖醇(DTT)還原二硫鍵,用胰蛋白酶(trypsin)酶解,37 ℃過夜處理,然后用10%的三氟乙酸終止酶解反應(yīng),所得到的肽段用含0.1%的三氟乙酸的50%丙酮溶液提取兩次,然后將提取好的肽段用真空離心濃縮儀進(jìn)行濃縮,再用0.1%的甲酸超純水復(fù)溶,高速離心混勻,用于質(zhì)譜檢測。

    1.2.2 Lunaisn標(biāo)準(zhǔn)品的配制

    圖1 大豆提取物及Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAG電泳圖Fig.1 SDS-PAG electrophoresis of soybean extractsand lunaisn standard

    Lunaisn標(biāo)準(zhǔn)品的配制:精密稱取Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品20 mg,配成20 mg/mL的高標(biāo),并梯度稀釋為2000 mg/L,100 mg/L、500 mg/L、250 mg/L和125 mg/L。SDS-PAGE和酶解用同上1.2.1所述的條件進(jìn)行處理。

    1.2.3 Lunasin的測定

    用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap)平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)測定六種大豆中Lunasin含量。

    色譜條件:色譜柱:EASY-Spray column (50 μm×15 cm,2 μm);柱溫:25 ℃;流速:300 nL/min;進(jìn)樣體積2 μL;A液:0.1%甲酸水溶液,B液:0.1%甲酸的乙腈溶液;洗脫程序如表1所示。

    質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧電離源(ESI);掃描方式:平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM);采用正離子模式,離子傳輸管溫度320 ℃;一級全掃描范圍為m/z 350~1550,自動增益控制(AGC)和離子注入時間(IT)分別設(shè)為2.0e5和50 ms;二級掃描(dd-MS2) AGC設(shè)為5.0e4,離子注入時間IT設(shè)為100 ms,碰撞能量為32 eV,對所有質(zhì)譜結(jié)果使用Proteome Discover(Vesion PD1.4)軟件在Uniprot/Swiss-prot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,得到最合適的鑒定結(jié)果。

    表1 洗脫程序Table 1 Elution program

    2 結(jié)果與討論

    2.1 大豆提取物及Lunasin電泳結(jié)果

    恒定電壓80 V電泳120 min,以考馬斯亮藍(lán)G-250染色后脫色,以Marker及陽性對照Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品作為參照物,電泳結(jié)果見圖1。從大豆提取物及Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品電泳結(jié)果圖中可以看出,在2號陽性對照Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品條帶相應(yīng)的位置,3~8號都有條帶出現(xiàn),可能是多肽Lunasin。六種大豆的提取物的電泳條帶樣式近似,但顏色深淺不同。

    2.2 Lunasin含量的測定

    圖2 標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖和一級質(zhì)譜圖Fig.2 Total ion chromatogram and mass spectrogram of standard substance

    2.2.1 Lunasin定量肽段的確定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

    如圖2所示是酶解后的標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖和一級質(zhì)譜圖,從總離子流圖中可以看出,響應(yīng)最強(qiáng)的化合物保留時間為26.53~27.37 min的峰,一級質(zhì)譜圖顯示該峰對應(yīng)的質(zhì)荷比(m/z)是693.86377。用NCBI中大豆蛋白庫Blast檢索得QLQGVNLTPCEK是大豆中Lunasin的特異性肽段,是其氨基酸序列SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGR GDDDDDDDDD中的一部分,符合胰蛋白酶酶切位點(diǎn)特征,實(shí)際檢測出來的m/z是693.86377(理論值693.85999,誤差5.81×10-6),誤差小于10×10-6,可以認(rèn)為是同一肽段。

    我們用Lunasin酶解后的特征性肽段QLQGVNLTPCEK來進(jìn)行定量。如圖3所示是Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品的二級質(zhì)譜圖,從圖中可以看出響應(yīng)最高的離子為y4+離子。因此,選擇肽段QLQGVNLTPCEK,母離子m/z為693.86377,特征子離子y4+m/z為533.24133,來進(jìn)行大豆中Lunasin的定量。

    圖3 標(biāo)準(zhǔn)品二級質(zhì)譜圖Fig.3 Two stage mass spectrogram of standard substance

    按照1.2.2中的方法,Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品為2000 mg/L、1000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L和125 mg/L系列稀釋溶液用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap),平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)法依次進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積對其濃度進(jìn)行線性回歸,質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果顯示得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7993552.01x-1264601495.50,R2=0.998,線性關(guān)系良好,適用于定量分析。

    2.2.2 精密度及樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

    精密度實(shí)驗(yàn):取2.2.1標(biāo)準(zhǔn)品溶液,以2 μL進(jìn)樣量連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算得峰面積的RSD分別為0.21%。

    回收率實(shí)驗(yàn):樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)參照許高燕[15]的方法,取同一大豆樣品粉末2份各100 mg,一份作為對照,另一份加入0.2 mg Lunasin標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.2.3中方法提取并進(jìn)行NanoLC-Obitrap分析,重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:PRM方法測定大豆中Lunasin含量,可操作性強(qiáng),方法準(zhǔn)確可靠,回收率為81.00%,RSD為2.10%。結(jié)果顯示,本法具有較好的重復(fù)性與靈敏度,適用于定量分析。

    2.2.3 六種國產(chǎn)栽培大豆中Lunasin含量測定

    取中黃13大豆、中黃75大豆、徐豆14大豆、黑河43大豆、黔豆7號大豆、皖豆35大豆,各100 mg,按上述方法,用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap),平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)法依次進(jìn)行檢測其中多肽Lunasin含量,具體結(jié)果見表2。

    表2 六種國產(chǎn)栽培大豆中Lunasin含量Table 2 Lunasin content in six different cultivars of domestic soybeans

    3 結(jié)論

    本文利用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap)平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)對六種國產(chǎn)大豆中Lunasin的含量進(jìn)行了測定。發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)的六種大豆中均含有Lunasin,皖豆35大豆中Lunasin含量最高,為4.66 mg/g;中黃13中含量為2.24 mg/g;中黃75中含量為3.35 mg/g;徐豆14中含量為2.59 mg/g;黔豆7號中含量為2.03 mg/g;黑河43號含量為2.87 mg/g。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆中Lunasin含量豐富。

    本研究以國產(chǎn)六種大豆為實(shí)驗(yàn)材料,建立了提取大豆多肽Lunasin的方法,采用SDS-PAGE分離的方法降低了基質(zhì)干擾,并采用納流液相色譜串聯(lián)軌道阱質(zhì)譜(NanoLC-Obitrap)平行反應(yīng)監(jiān)視法(PRM)對大豆中Lunasin含量進(jìn)行測定。本測定方法準(zhǔn)確可靠,重現(xiàn)性好。為全面認(rèn)識不同品種大豆中Lunasin及優(yōu)質(zhì)蛋白和多肽,開展大豆品種營養(yǎng)評價奠定了必要的理論基礎(chǔ)。同時Lunasin作為大豆中目前發(fā)現(xiàn)的含量較高的多肽,通過該分析方法檢測多肽的含量,可以用于篩選富含Lunasin大豆的優(yōu)勢品種,或許可能作為大豆質(zhì)量評價的一個方法,為功能性食品的開發(fā)提供支撐。

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