西瓜花葉病毒遼寧臭椿分離物的鑒定與全序列分析

付晶晶，楊彩霞，韓 彤，廖一鳴，王 昕，付春亭，馮 雨，武井昕

(沈陽(yáng)大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院/遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110044)

西瓜花葉病毒(Watermelonmosaicvirus,WMV)是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的成員。病毒粒子為彎曲線狀，無(wú)包膜，直徑 11～13 nm，典型長(zhǎng)度為680～900 nm[1]?；蚪M是長(zhǎng)約9.7 kb的單分子線形正義ssRNA，編碼一個(gè)長(zhǎng)的多聚蛋白，隨后切割產(chǎn)生8～10個(gè)產(chǎn)物參與病毒的復(fù)制、運(yùn)動(dòng)和包裝。在自然界中，主要以蚜蟲(如桃蚜和棉蚜)以非持久性方式進(jìn)行傳播[2]，也能通過(guò)汁液摩擦傳染。WMV寄主范圍廣泛，除主要侵染葫蘆科(西瓜、瓠瓜、西葫蘆、南瓜、黃瓜、甜瓜、羅漢果、冬瓜和哈密瓜)植物[1,3-7]之外，還可侵染茄科(甜椒)、五加科(人參)、錦葵科(野葵)、豆科(刺槐)、蘭科(石斛蘭)、西番蓮科(百香果)和蕓香科(檸檬)等多種植物[8-11]，造成植物葉片花葉和皺縮、生長(zhǎng)受阻、坐瓜難、畸形果等問(wèn)題，使產(chǎn)量和商品性降低，直接影響種植者的收益。在中國(guó)，WMV已在山東、山西、新疆、上海、北京、海南、新疆和陜西等地的葫蘆科植物(西瓜和南瓜)、胡麻科(芝麻)和苦木科(臭椿)上[12-21]被發(fā)現(xiàn)。2015年，在遼寧蓋州地區(qū)采集到花葉癥狀的臭椿，通過(guò)透射電鏡觀察和RT-PCR擴(kuò)增病毒的全基因組序列，明確了侵染臭椿的病毒為WMV。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

圖1 表現(xiàn)花葉癥狀的臭椿Fig.1 The Ailanthus altissima plants showing yellow mosaic symptoms

2015年10月，于遼寧省蓋州市采集表現(xiàn)花葉癥狀的臭椿(Ailanthusaltissima)，移回本實(shí)驗(yàn)室栽培(圖1)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 透射電鏡觀察法 在高壓滅菌的研缽中加少量PB溶液，將新鮮病葉放置其中研磨至勻漿狀，6 000 r/min，離心3 min。吸取上清液，將銅網(wǎng)放入其中漂染3 min后，置2%磷鎢酸中染色10 s，于透射電鏡下(Hitachi TEM system)觀察。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)病毒基因組 采用TRIzol法對(duì)臭椿病葉的總RNA進(jìn)行提取，實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。稱取1 g植物樣品于研缽中，加入液氮研成粉末，移入1.5 mL Eppendorf管，立即加入1 mL TRIzol，室溫放置10 min以裂解細(xì)胞；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積氯仿并劇烈震蕩，室溫放置3 min；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；取上清并加入0.6倍體積異丙醇，充分混勻4 ℃過(guò)夜；4 ℃，12 000 r/min離心15 min；棄上清，用1 mL 75%無(wú)水乙醇洗滌沉淀；4 ℃，12 000 r/min 離心15 min；棄上清，室溫干燥，加入RNase-free H2O溶解。隨后，以O(shè)ligo(dT)作為引物，使用TIANScript RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)對(duì)已提取的RNA進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。

以該cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PVY通用引物PVY-Legpoty-F/PVY-Legpoty-R(5′-GCWKCHATGATYGARGCHTGGG-3′/5′-AYYTGYTYMYCHCCATCCAT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。病毒全基因組序列由三對(duì)引物擴(kuò)增，WMV-5NF/WMV-5NR(5′-AAATTAAAACWACTCATAAAGA-3′/5′-CCTTGTAGTACGCTGGTCATCTG-3′)、WMV-MNF/WMV-MNR5′-CTCCACATACGGAGAAATG-3′/5′-CCAACCATACAAACTCGCTC-3′)和WMV-3NF/WMV-3NR5′-ATGTWGGAGTTGGGTATGG-3′/5′-AGGTACGGTAATGTTTGTTGTTCC-3′)擴(kuò)增得到，PCR反應(yīng)體系為25 μL，循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。引物由沈陽(yáng)力新生物技術(shù)有限公司合成。

PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用TIANgel Midi Purification Kit(天根生化科技(北京)有限公司)凝膠回收試劑盒對(duì)目的DNA條帶進(jìn)行回收和純化。回收產(chǎn)物與pMD18-T(寶生物工程(大連)有限公司)克隆載體于16 ℃溫育3 h后，導(dǎo)入DH5α菌株的感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。次日，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中，280 r/min，37 ℃搖床培養(yǎng)7 h，取2 μL菌液進(jìn)行PCR鑒定。選取陽(yáng)性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序。

1.2.3 序列分析 通過(guò)使用DNAStar(DNASTAR Inc.,Madison,USA)和DNAMAN Version 6.0(Lynnon Biosoft,Quebe Canada)軟件完成對(duì)測(cè)序結(jié)果的處理。采用Clustal_X version 1.83[22]軟件和Mega version 7.0[23]軟件對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行完全比對(duì)及繪制親緣關(guān)系樹，種子重復(fù)數(shù)為1 000。分支節(jié)點(diǎn)數(shù)值為后驗(yàn)概率，大于50%的數(shù)值被顯示。等借助DNAStar和DNAMAN軟件完成。利用NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)的BLAST程序進(jìn)行同源序列搜索。親緣關(guān)系樹繪制所使用的序列信息見表1。

表1 WMV臭椿分離物與其它報(bào)道WMV分離物的cp基因的序列同源性

2 結(jié)果與分析

2.1 臭椿病葉樣品電鏡觀察結(jié)果

新鮮臭椿病葉于透射電鏡下進(jìn)行病毒粒子的負(fù)染色觀察，可見800 nm×18 nm的線性粒子，病毒粒子外表面無(wú)包膜(圖2)。

圖2 臭椿病葉中的線性病毒粒子Fig.2 Virus particles are flexuous filaments in Ailanthus altissima diseased leaves

2.2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

利用PVY-legpoty-F/R引物對(duì)臭椿病葉的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到約750 bp的特異性片段(圖3，泳道1～3)，而健康臭椿中沒(méi)有檢測(cè)到該片段(圖3，泳道4)。

利用三對(duì)引物WMV-5NF/WMV-5NR、WMV-MNF/WMV-MNR和WMV-3NF/WMV-3NR對(duì)臭椿病葉的cDNA進(jìn)行全長(zhǎng)基因組的擴(kuò)增分別得到3 500 bp(圖4，泳道1和2)、3 500 bp(圖4，泳道4和5)、3 000 bp和750 bp(圖4，泳道7和8)的基因組片段，健康植物中無(wú)任何條帶(圖4，泳道3、6和9)。所有陽(yáng)性條帶回收后克隆測(cè)序，經(jīng)拼接得到全長(zhǎng)基因組序列。

PVY-legpoty-F/R 引物擴(kuò)增結(jié)果；M：Marker DL2000；1-3：臭椿病葉；4：臭椿健康葉片；5：為水Results amplified by PVY-legpoty-F/R M:Marker DL2000;1～3:Disease leaves of Ailanthus altissima;4:Healthy plants;5:Water圖3 臭椿病葉中Potyvirus病毒的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detected results of Potyvirus of disease leaves of Ailanthus altissima

M：Marker DL15000；1～3：WMV-5NF/WMV-5NR檢測(cè)結(jié)果；4～6：WMV-MNF/WMV-MNR檢測(cè)結(jié)果；7～9：WMV-3NF/WMV-3NR檢測(cè)結(jié)果。1、2、4、5、7和8為臭椿病樣;3、6和9為健康植物M:Marker DL15000;1-3:Products amplified by WMV-5NF/WMV-5NR;4-6:Products amplified by WMV-MNF/WMV-MNR;7-9:Products amplified by WMV-3NF/WMV-3NR;3,6 and 9 are healthy plants圖4 臭椿病葉的WMV病毒全長(zhǎng)基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Genome of WMV virus disease leaves of Ailanthus altissima full-length PCR fragment amplification results

2.3 序列分析

WMV遼寧蓋州臭椿分離物基因組全長(zhǎng)為10 070 bp(MF418043)。其編碼的多聚蛋白通過(guò)蛋白酶的剪接可形成10個(gè)小的多肽，從N段到C段依次切割成P1(135-1 466 nt，1 332 bp，444 aa)、HC-Pro(1 467-2 837 nt，1 371 bp，457 aa)、P3(2 838-3 878 nt，1 041 bp，347 aa)、6K1(3 879-4 034 nt，156 bp，52 aa)、CI(4 035-5 939 nt，1 905 bp，635 aa)、6K2(5 940-6 098 nt，159 bp，53 aa)、VPg(6 099-6 668 nt，570 bp，190 aa)、NIa-Pro(6 669-7 397 nt，729 bp，243 aa)、NIb-Pro(7 398-8 948 nt，1 551 bp，517 aa)、CP(8 949-9 797 nt，849 bp，282 aa)。

基于cp基因的氨基酸和核苷酸序列，將遼寧臭椿分離物與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的WMV分離物進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，它與北京臭椿分離物同源性最高，氨基酸同源性為93.3%，核苷酸同源性為89.8%?；赾p基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，WMV的亞洲、歐洲、美洲和澳洲等分離物聚集在一個(gè)大分支上，其中，遼寧臭椿分離物與中國(guó)北京臭椿分離物WMV-[CN:BJ:Ailanthus altissima](KF274031)最近，結(jié)果與同源性比對(duì)結(jié)果一致。CGMV-[CN:LN](EF611826)作為群外組單獨(dú)成一個(gè)分支(圖5)。根據(jù)第九次病毒分類委員會(huì)報(bào)道的Potyvirus分類標(biāo)準(zhǔn)[24-25](cp基因的核苷酸同源性低于76%，或者cp基因的氨基酸同源性低于80%，可認(rèn)為是PVY屬的一個(gè)新種)，可判定侵染遼寧蓋州地區(qū)采集的花葉癥狀臭椿的病毒是西瓜花葉病毒(WMV)。

圖5 基于WMV遼寧分離物及32個(gè)已報(bào)道WMV cp核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on cp nucleotide sequences of WMV Liaoning isolate and 32 previously reported WMV isolates

3 討 論

臭椿(Ailanthusaltissima)，屬苦木科(Simaroubaceae)臭椿屬(AilanthusDesf.)落葉喬木，生長(zhǎng)迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，容易繁殖，材質(zhì)優(yōu)良。由于臭椿在建筑和家具制作、綠化美化(觀賞樹和行道樹)、藥用(消炎、殺菌、抗病毒和抗腫瘤等)和生態(tài)等方面的應(yīng)用價(jià)值，被廣泛種植于中國(guó)各地。臭椿葉片特殊臭味具有很強(qiáng)的殺菌除蟲功效，因此，它對(duì)病蟲害抵抗能力較強(qiáng)，受病蟲害危害較少。至今，已報(bào)道的與臭椿花葉病害相關(guān)的病毒僅有WMV[21]、TMV(Tobaccomosaicvirus)[26]和CMV(Cucumbermosaicvirus)[27]。本研究通過(guò)病毒粒子的形態(tài)觀察、基因組全長(zhǎng)序列分析和cp基因的同源性分析，首次確定遼寧蓋州臭椿花葉病與WMV有關(guān)。WMV的自然寄主絕大多數(shù)都是草本植物，那么，它是如何避開臭椿較強(qiáng)的抵抗能力，成功在植物體內(nèi)大量繁殖并引起明顯的花葉癥狀呢？這種適應(yīng)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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