柳樹病葉的傅里葉變換紅外光譜研究

劉艷,司民真,李倫,張德清

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，昆明　650500;2.楚雄師范學(xué)院云南省高校分子光譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楚雄　675000;

3.楚雄師范學(xué)院光譜應(yīng)用技術(shù)研究所，楚雄　675000)

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柳樹病葉的傅里葉變換紅外光譜研究

劉艷1,司民真2,3*,李倫2,3,張德清2,3

(1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，昆明650500;2.楚雄師范學(xué)院云南省高校分子光譜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，楚雄675000;

3.楚雄師范學(xué)院光譜應(yīng)用技術(shù)研究所，楚雄675000)

摘要:利用傅里葉變換紅外(FTIR)光譜技術(shù)對三種柳樹正常葉和病葉，同一枝條的幼葉、成葉、黃葉、病葉進(jìn)行光譜測試，旨在分析柳樹病葉發(fā)生的一些生理變化，并探討柳樹病變對系統(tǒng)聚類的影響。譜圖顯示不同階段的葉片光譜變化主要在1800～800 cm-1。對此波段進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，清晰可看到蛋白質(zhì)和木質(zhì)素的疊加區(qū)域1700～1500 cm-1，草酸鈣特征峰1621、1318 cm-1，糖類特征峰1075 cm-1附近峰強(qiáng)有明顯變化，用吸光度比A1621/A3390、A1318/A3390、A1075/A3390來比較草酸鈣和糖類相對含量變化，用1700～1500 cm-1波段的擬合峰面積比S酰胺I/S木質(zhì)素、S酰胺Ⅱ/S木質(zhì)素和S酰胺Ⅱ/S酰胺I來比較蛋白質(zhì)相對含量變化。結(jié)果顯示，病葉的草酸鈣相對含量增加、多糖和蛋白質(zhì)相對含量在減少。將葉片1800～800 cm-1范圍的二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，發(fā)現(xiàn)病葉化學(xué)成分的改變沒有影響聚類效果，聚類正確率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞：傅里葉變換紅外光譜; 聚類分析; 吸光度; 病葉

1引言

柳樹是楊柳科( Salicaceae)柳屬( Salix )植物的通稱，為木本植物。柳屬植物具有繁殖易、用途廣、生長快等特點(diǎn)，是重要的園林綠化植物，也是優(yōu)良的防護(hù)、蜜源、造紙、建筑樹種，如旱柳、白柳和垂柳等。從目前關(guān)于柳樹的利用來看，已從以前的木材生產(chǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榫坝^植物的種植和藥用產(chǎn)品的生產(chǎn)[1]。傣醫(yī)學(xué)里用柳屬植物主治腹痛腹瀉、疥癬、皮膚瘙癢、 濕疹、斑疹[2]；中醫(yī)藥學(xué)里用柳屬植物主治急慢性肝膽炎、結(jié)石、痔瘡、燙傷、梅毒、跌打損傷[3]。阿斯匹林的解熱鎮(zhèn)痛神效廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)，而它的發(fā)明起源于隨處可見的柳樹。據(jù)報(bào)道，柳樹中廣泛存在解熱鎮(zhèn)痛的水楊苷及其衍生物活性物質(zhì)，其中在垂柳葉片中，含量可高達(dá)3%～4%[4]。其次，柳葉具有豐富的鞣質(zhì)和碘，清熱解毒，是治療地方性甲狀腺腫大的良藥。民間醫(yī)藥學(xué)中，人們將常見的垂柳葉搗碎外敷，來治療足跟疼痛，然而，柳葉在成長過程中會發(fā)生一些病變，病變過程中化學(xué)成分就會相應(yīng)受到影響，從而發(fā)生一些復(fù)雜的生理變化，這些病變直接影響到植物的觀賞價值，但不知是否會影響到藥效？能否利用紅外光譜來找出病變?nèi)~發(fā)生的一些變化？本文基于FTIR對柳葉的病變做一個基礎(chǔ)研究，選用最常見、觀賞及藥用價值極高的垂柳、白柳、旱柳來測試紅外光譜，對其化學(xué)成分如蛋白質(zhì)、草酸鈣、多糖的變化做一個對比，以期為柳屬植物的采集及疾病控制提供參考。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1實(shí)驗(yàn)儀器

紅外光譜儀為PerkinElmer公司的Frontier傅里葉變換紅外光譜儀，掃描范圍4000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16次。

2.2樣品制備、檢測及數(shù)據(jù)處理

垂柳正常葉、白柳正常葉、旱柳正常葉、垂柳病葉、白柳病葉、旱柳病葉，三個不同品種柳樹共36個樣本；垂柳同一時期同一枝條上的幼葉、成葉、黃葉、病葉，共40個樣本。76個樣品均采自于云南師范大學(xué)。樣品清洗后晾干，取相同部位進(jìn)行研磨成粉末，加入溴化鉀攪磨均勻，壓片測紅外光譜。光譜均扣除溴化鉀背景，光譜數(shù)據(jù)用Omnic 8.0軟件處理，經(jīng)過基線校正、9點(diǎn)平滑、歸一化處理。用軟件Origin 8.5畫光譜圖及進(jìn)行曲線擬合處理，用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行聚類分析。

3結(jié)果與分析

3.1柳葉的光譜峰歸屬

圖1是三種柳樹的正常葉和病葉的紅外光譜圖。3390 cm-1附近為O-H、N-H伸縮振動，來自于多糖和蛋白質(zhì)[5]；2921 cm-1、2852 cm-1主要來自C-H反對稱伸縮振動、對稱伸縮振動吸收[6]。在1700～1200 cm-1范圍內(nèi)以及在780 cm-1附近有多個峰存在，表明柳葉中有黃酮類化合物[7]。其中1730 cm-1附近為C=O伸縮振動；1621 cm-1附近的吸收峰來自草酸鈣中的芳香環(huán)骨架振動吸收；1425 cm-1的吸收峰可能包含C-H彎曲振動吸收以及C-O伸縮振動吸收[8]。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，在2927、2854、1626、1045 cm-1附近有吸收峰出現(xiàn)，表明有β-谷甾醇。1300～950 cm-1范圍主要為各類C-O伸縮振動吸收峰，說明有萜類物質(zhì)[8]。其中1318 cm-1附近是草酸鈣中C-O鍵的對稱伸縮振動；1253 cm-1附近的弱峰為C-O-C骨架振動以及酰胺Ⅲ的貢獻(xiàn)[10]；1075 cm-1附近為糖類C-O振動吸收區(qū)；782 cm-1為草酸鈣中C-O鍵的彎曲振動。在3390、1318、1253、1075 cm-1附近有吸收峰出現(xiàn)，表明有羥基、甲氧基苯環(huán)的存在[8]，推斷出是水楊苷的特征峰。對照李倫等[11]的草酸鈣圖譜，柳葉在1621、1318、782 cm-1附近均有吸收峰出現(xiàn)。由以上紅外譜峰的結(jié)構(gòu)特征得知，柳葉中含有黃酮類、萜類、水楊苷、β-谷甾醇、草酸鈣等化合物，這和趙紅娟等[12]的結(jié)論相吻合。

3.2柳樹正常葉和病葉的光譜差異

從圖1可看出圖譜峰位、峰形大體相似,但在1800～800 cm-1范圍三種柳樹的正常葉和病葉的光譜峰強(qiáng)有區(qū)別，為了進(jìn)一步觀察正常葉和病葉間的差異，將1800～800 cm-1范圍進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理(見圖2)，以增加圖譜的分辨率。圖1中，對比草酸鈣的特征峰1621、1318 cm-1和糖類特征峰1075 cm-1處的峰強(qiáng)，6種葉片差異明顯。用吸光度比值法A1621/A3390、A1318/A3390、A1075/A3390來定義草酸鈣、糖相對含量的變化[11]。垂柳正常葉A1621/A3390、A1318/A3390、A1075/A3390為0.07、0.08、0.17，垂柳病葉0.14、0.55、0.04，白柳正常葉0.118、0.092、0.75，白柳病葉1.355、1.164、0.64，旱柳正常葉0.434、0.069、1.12，旱柳病葉0.872、0.10、0.96。正常葉的吸光度比值A(chǔ)1621/A3390、A1318/A3390均低于病葉，而A1075/A3390比值均高于病葉。相對強(qiáng)度的差異說明，病葉的草酸鈣含量多于正常葉，糖類相對含量少于正常葉。

Fig.1FTIR spectra of different salix leaf. a: weeping willow leaf normol,b: Bailiu normol leaf,c: normal leaf plants,d: weeping willows disease leaves, g: Bailiu disease leaves, f: plants disease leaves

圖2中，二階導(dǎo)增大了圖譜間的差異，可清晰地看出，在1620 cm-1、1318 cm-1附近垂柳病葉比垂柳正常葉、白柳正常葉、白柳病葉、旱柳正常葉和旱柳病葉峰值強(qiáng)，說明不同品種的柳葉草酸鈣含量不一樣，其中，垂柳病葉的草酸鈣含量最高。葉片在1604 cm-1、1514 cm-1、1454 cm-1等處峰強(qiáng)較強(qiáng)，結(jié)合1740 cm-1、1660 cm-1附近的羰基吸收峰，說明其中黃酮類物質(zhì)較多[8]。1700～1500 cm-1波段(虛線框出的區(qū)域)為酰胺I帶和木質(zhì)素疊加區(qū)域，差異明顯，因此采用曲線擬合技術(shù)對6種葉片在1700～1500 cm-1波段進(jìn)行分峰擬合，見圖3(選取具有典型性光譜特征垂柳正常葉(a)和病葉(b)作為光譜代表),用子峰的相對面積來考察蛋白質(zhì)的含量差異。

Fig.2Different salix leaf of the second derivative spectra(1800～800 cm-1). a: weeping willow leaf normol,b: Bailiu normol leaf,c: normal leaf plants,d: weeping willows disease leaves,g: Bailiu disease leaves,f: plants disease leaves

Fig.3　Curve fitting figure(1700～1500 cm-1). (A)weeping willow leaf normol,(B) weeping willows disease leaves

利用origin8.5軟件進(jìn)行分峰擬合得到四個子峰：1556、1595、1618、1655 cm-1，1655 cm-1附近的峰主要是蛋白質(zhì)酰胺I帶，1556 cm-1附近的峰主要是蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶，1595 cm-1附近是木質(zhì)素的吸收峰,1618 cm-1是草酸鈣的吸收峰。定義用吸收峰面積比S酰胺I/S木質(zhì)素、 S酰胺Ⅱ/S木質(zhì)素和S酰胺Ⅱ/S酰胺I來判斷葉片中蛋白質(zhì)相對含量的變化[11]，列于表1。

Table.1　Sub peak area ratio for disease leaves and normal

從表1中可以得出，三種柳樹正常葉的Samide I/Slignin、Samide Ⅱ/Slignin的比值均高于病葉，且正常葉的比值均大于1，病葉的比值均小于1，說明正常葉的蛋白質(zhì)相對含量多于病葉，且正常葉中蛋白質(zhì)相對含量多于木質(zhì)素，病葉中木質(zhì)素相對含量多于蛋白質(zhì)。其次，垂柳的正常葉和病葉Samide I/Slignin、Samide Ⅱ/Slignin均高于白柳和旱柳的正常葉和病葉，且6種葉片Samide Ⅱ/SamideI的比值均大于1。由以上的分析表明：(1)病葉的蛋白質(zhì)含量很少，木質(zhì)素較多。(2)三種柳樹中，垂柳的蛋白質(zhì)相對含量是最多的。(3)柳樹葉片中蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶的相對含量多于酰胺I 帶。

通過以上的分析，由三種柳樹正常和病變?nèi)~的對比得出：相對于健康葉片，柳樹病葉草酸鈣和木質(zhì)素相對含量較多，糖類和蛋白質(zhì)相對含量較少。

3.3同種柳葉成長及病變的光譜變化

三種柳樹的紅外譜圖及化合物相對含量大體相似，因此選用觀賞價值極高、分布廣泛的垂柳作為研究對象，取同一時期、同一枝條上的幼葉、成葉、老葉、病葉來采集光譜。隨著葉片成長到病變，葉片會發(fā)生一些生理變化，如蛋白質(zhì)、草酸鈣、多糖會被消耗、降解和轉(zhuǎn)移[11]，因此，這些變化將會引起紅外譜圖的變化，見圖4。圖4是垂柳幼葉、成葉、老葉、病葉的紅外光譜，不同生長期的譜峰位置大體相似，但有一些特征峰的強(qiáng)度和峰位有變化。在1620 cm-1附近，幼葉、黃葉的峰出現(xiàn)在1609 cm-1，移了11個波數(shù)；在1075 cm-1附近，幼葉出現(xiàn)了兩尖峰；不同生長時期，1318 cm-1附近的峰強(qiáng)明顯不同。從幼葉到病葉，吸光度比A1621/A3390、A1318/A3390、A1075/A3390為：幼葉(0.036、0.04、0.34)，成葉(0.84、0.77、0.15)，老葉(0.053、0.027、0.06)，病葉(0.224、0.167、0.02)，從比值的變化看出，葉片在成長過程中，草酸鈣含量先增加后減少，糖類一直在減少；發(fā)生病變時，草酸鈣含量很高，糖類始終在減少，這可能是以多糖的消耗轉(zhuǎn)化來滿足旺盛部位的營養(yǎng)需求而導(dǎo)致的[11]。

Fig.4IR spectra of the different stages of willow. a:young b:mature c:old d: disease leaves

選取特征區(qū)域1800～800 cm-1波段進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理，見圖5，發(fā)現(xiàn)成葉(圖5b)、病葉(圖5d)的1318 cm-1強(qiáng)度明顯高于幼葉和老黃葉。1075 cm-1在成長過程中強(qiáng)度逐漸降低，和吸光度比值結(jié)論相一致。對圖5虛線框出的區(qū)域，1700～1500 cm-1進(jìn)行曲線擬合，擬合曲線見圖6。

Fig.5Different stages of the second derivative spectra willow(1800～800 cm-1).a: young,b: mature,c: old,d: disease leaves

Fig.6　Curve fitting figure(1700～1500 cm-1).(a)young,(b)mature,(c)old,(d)disease leaves

幼葉、成葉、黃葉、病葉的曲線擬合得到1654、1609、1564、1519 cm-1附近四個子峰，相對面積見表2。從表2中可以得出，相對子峰面積之比均大于1，且幼葉、成葉、老葉的Samide I/Slignin、Samide Ⅱ/Slignin、Samide Ⅱ/Samide I的比值一直在增大，到了病葉，比值急劇減小。由此說明：(1)垂柳葉片在成長過程中，蛋白質(zhì)相對含量逐漸在增多，說明蛋白質(zhì)在老黃葉中有積累，且酰胺Ⅱ的相對含量多于酰胺 I的相對含量。(2)當(dāng)葉片發(fā)生病變后，蛋白質(zhì)相對含量在減少，說明蛋白質(zhì)可能發(fā)生了轉(zhuǎn)移。(3)葉片成長過程和發(fā)生病變過程，蛋白質(zhì)相對含量始終大于木質(zhì)素相對含量。

Table.2　Sub peak area ratio for young,mature,old,and disease leaves

通過以上的分析，由垂柳幼葉、成葉、老葉、病葉的對比得出：處于不同階段的柳葉，草酸鈣含量先增加后減少再增加，糖類含量一直在減少，蛋白質(zhì)含量增加后再減少。

3.4聚類分析

柳葉病變引起了一些化學(xué)成分的變化，致紅外譜峰有所差異，現(xiàn)將樣品進(jìn)行聚類分析，來研究病變?nèi)~是否影響聚類效果。聚類時將三種柳樹的成葉和病葉放在一起聚類，再將一種柳樹的幼葉、成葉、黃葉和病葉放在一起聚類。選取樣本二階導(dǎo)數(shù)光譜在1800～800 cm-1范圍的吸光度值，使用系統(tǒng)聚類(HCA)法，采用余弦距離進(jìn)行聚類分析。聚類結(jié)果如圖7、8所示。

圖7中，在距離7左右，垂柳正常葉、垂柳病葉、白柳正常葉、白柳病葉、旱柳正常葉、旱柳病葉聚為六類，36個樣品均被區(qū)分，每種柳樹的6個樣品均聚在一塊，聚類正確率達(dá)100%。說明發(fā)生病變的葉片并沒有影響到不同種柳樹的聚類，且系統(tǒng)聚類分析對六種柳葉樣本有很好的聚類作用。

圖8中，在距離4左右，幼葉、成葉、黃葉、病葉全部被區(qū)分開，成葉、黃葉、病葉的10個樣本都聚在一起，幼葉有兩個樣本被混聚在成葉中，兩個樣本混聚在黃葉中，一個樣本單獨(dú)聚類。相比之下，幼葉聚類效果不太好，原因可能是幼葉生長比較快，生長過程中蛋白質(zhì)、多糖等化合物變化較快，不穩(wěn)定，從而影響了聚類，而病葉聚類正確率達(dá)100%。

Fig.7Normal leaf and second derivative spectra of diseased leaves in 1800~800 cm-1range of cluster diagram

4結(jié)論

本文利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)法對柳葉共76個樣品進(jìn)行了光譜測試，結(jié)果顯示，柳葉發(fā)生病變以后，紅外光譜的變化主要在蛋白質(zhì)的吸收區(qū)1700～1500 cm-1、草酸鈣特征峰和糖類特征峰。正常葉和病葉、不同階段的柳葉峰位、峰強(qiáng)及吸光度比值、曲線擬合相對面積比的變化及差異，反映了病葉的蛋白質(zhì)、糖類、草酸鈣等化合物發(fā)生了一些消耗、降解等復(fù)雜的生理變化，而使相應(yīng)化合物的相對含量發(fā)生變化。對1800～800 cm-1波段的二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，發(fā)現(xiàn)病葉沒有因?yàn)榛衔锏淖兓绊懢垲愋Ч?，但是否會影響到藥效，這有必要進(jìn)行下一步的研究。

Fig.8Different stages of the second derivative spectra willow(1800～800 cm-1)of cluster diagram

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Study of Willow Diseased Leaves by Fourier Transform Infrared Spectroscopy

LIU Yan1,SI Min-zhen2,3*,LI Lun2,3,ZHANG De-qing2,3

(1.SchoolofPhysicsandElectronicInformation,YunnanNormalUniversity,Kunming650500,Yunnan,China;2.YunnanKeyLaboratoryofuniversitiesforMolecularSpectrum;3.Instituteofspectralappliedtechnology,ChuxiongNormalUniversity,Chuxiong675000,China)

Abstract:Using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy of three willow leaf and leaf disease,the young leaves of the same branch and leaves,yellow leaves,leaf disease spectrum testing,aims to analyze the willow leaf disease of some physiological changes,to explore the effect of disease leaves on the clustering of the system. Infrared spectroscopy blade at different stages of major change in 1800~800 cm-1,this bands second derivative processing,you can clearly see the superimposed region of the protein and lignin 1700~1500 cm-1,characteristic peaks of calcium oxalate 1621,1318 cm-1,characteristic peaks carbohydrate peak near 1075 cm-1strong there are significant changes,with absorbance ratio A1621/A3390,A1318/A3390,A1075/A3390to compare the relative content of calcium oxalate and sugar,with 1700~1500 cm-1band fitting peak area ratio Samide I/Slignin,SamideⅡ/Sligninand SamideⅡ/Samide Iused to compare the relative amounts of the protein. The results showed that the relative contents of calcium oxalate in the diseased leaves were increased,and the relative contents of polysaccharide and protein decreased. The blade 1800~800 cm-1range of the second derivative of systematic cluster found diseased leaves change did not affect the chemical composition of the clustering effect,clustering correct rate of 100%.

Key words:FTIR; Hierarchical cluster analysis; dbsorbance ratio; diseased leaves

中圖分類號：O657.37

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi:10.13883/j.issn1004-5929.201601014

文章編號：1004-5929(2016)01-0084-07

作者簡介：劉艷(1990-)，女，云南，在讀碩士，主要從事生物光譜學(xué)方面研究. E-mail: 340596704@qq.com通訊作者：司民真,E-mail:siminzhen@hotmail.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(13064001,10864001)

收稿日期：2015-08-15; 修改稿日期: 2015-09-10