黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)及部分內(nèi)含子的多態(tài)性與生物信息學(xué)分析

封竣淇,羅衛(wèi)星,張依裕, 蔡惠芬*,羅 錚,徐 偉,翁吉梅,陳 說(shuō)

(1.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省仁懷市黔北麻羊原種場(chǎng)，貴州 仁懷 564500 )

【研究意義】黔北麻羊是經(jīng)原產(chǎn)地長(zhǎng)期自然環(huán)境選擇而成的貴州重要地方優(yōu)質(zhì)山羊品種之一[1]。因其具有食性廣、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼、適宜高寒山區(qū)飼養(yǎng)、肉質(zhì)鮮、口感佳和膻味輕等優(yōu)點(diǎn)[2]而深受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，隨著廣大居民消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，對(duì)羊肉的需求量逐年增加，使黔北麻羊個(gè)體小、凈肉率低和生長(zhǎng)較緩慢的缺點(diǎn)日益突出。因此，通過(guò)分子標(biāo)記輔助育種，選育高大、生長(zhǎng)性狀優(yōu)良和肉質(zhì)好、成熟快的黔北麻羊?qū)μ岣咂漯B(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Dickkopf-1(DKK1)基因最早于1998年在非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，2000年被證實(shí)其為Dickkopf(DKKS)家族成員之一，在脊椎動(dòng)物中DKKS家族還有DKK2、DKK3及DKK4等成員。DKK家族是一個(gè)保守基因家族，其家族基因結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是由含1個(gè)信號(hào)肽序列、2段富含半胱氨酸(Cys1、Cys2)的保守結(jié)構(gòu)域DKK-N和輔酯酶折疊(colipase fold)組成[3]。Cys1和Cys2分別位于氨基末端與羧基末端，二者形成的保守結(jié)構(gòu)域被可變連接區(qū)域分割，通常由50～55個(gè)氨基酸組成。Liu C等[4]研究表明，DKK1基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，可影響機(jī)體腫瘤生成、毛羽發(fā)生和脂肪細(xì)胞的分化等，其保守結(jié)構(gòu)域的存在對(duì)DKK1基因家族的生物學(xué)功能起著重要作用。近年來(lái)，前人對(duì)畜牧動(dòng)物的研究主要集中在其骨骼形成調(diào)控、脂肪細(xì)胞分化及骨再塑等方面，其作用機(jī)理主要是DKK1基因編碼一種分泌性糖蛋白，通過(guò)與Wnt蛋白競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合低密度脂蛋白受體相關(guān)的蛋白5/6(LRP5/6)來(lái)阻斷經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制 Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)動(dòng)物胚胎發(fā)育，參與其肌細(xì)胞生成、脂肪細(xì)胞分化、骨代謝、毛囊發(fā)育和腫瘤發(fā)展等。Qiang等[5]也在2008年通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DKK1基因?qū)φ{(diào)節(jié)骨代謝的分子機(jī)制。因此，DKK1基因作為Wnt信號(hào)通路的拮抗物，是調(diào)節(jié)動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)發(fā)育的重要基因?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以黔北麻羊?yàn)閷?duì)象，采用DNA池結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法研究黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)及部分內(nèi)含子的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件拼接黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)序列，并對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為黔北麻羊DKK1基因的深入研究及其種質(zhì)資源的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

130只黔北麻羊，由貴州省遵義市習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司(國(guó)家級(jí)黔北麻羊保種場(chǎng))與貴州省仁懷市黔北麻羊原種場(chǎng)提供。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 瓊脂糖(Biowest)；血液基因組提取試劑盒(生工生物)；2×EsTaqMaster Mix(英濰捷基)；DNA Ladder 2 000 Marker(英濰捷基)。

1.2.2 儀器 PCR儀(Bio-rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)，超微量紫外分光光度計(jì)(Therom)，電泳槽和電泳儀(北京六一)，微型掌上離心機(jī)(北京東林昌盛)，漩渦混合器(上海汗諾)，移液槍(Eppendorf)。

1.3 羊血樣品的采集

在黔北麻羊原種場(chǎng)，頸靜脈采集羊血后注入抗凝管，放于冰盒內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，放入-20 ℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的提取與DNA池的構(gòu)建

通過(guò)血液基因組試劑盒提取試驗(yàn)羊血液DNA，提取DNA用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定其DNA濃度 。然后將DNA樣品濃度稀釋為100 ng/μl，每個(gè)DNA樣品各取3 μl混勻后構(gòu)建黔北麻羊DNA池。

1.5 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

參考NCBI山羊DKK1基因(GenBank登錄號(hào):NC_030833.1)，用Primer Premier 5.0軟件在編碼區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增黔北麻羊DKK1基因編碼區(qū)序列及部分內(nèi)含子序列，引物送英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，其引物序列見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系為10 μl：5 μl 2×TaqPCR Master Mix試劑，2 μl 雙蒸水H2O，1 μl DNA樣品，上、下游引物各1 μl。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性溫度為95 ℃，時(shí)間5 min；變性溫度為95 ℃，時(shí)間30 s；退火時(shí)間為30 s；72 ℃延伸30 s；共32個(gè)循環(huán)；終延伸溫度為72 ℃，延伸7 min 30 s。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果用凝膠成像儀觀察。剩余PCR產(chǎn)物保存于4 ℃環(huán)境備用。

1.6 序列檢測(cè)與生物信息學(xué)工具

1.6.1 序列檢測(cè) PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選擇條帶明亮、清晰和膠片效果較好的PCR產(chǎn)物純化后，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAstar和BioEdit軟件進(jìn)行比對(duì)分析，經(jīng)手工拼接后獲得黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)序列，對(duì)其進(jìn)行開放閱讀框分析，結(jié)合測(cè)序峰圖篩選SNP位點(diǎn)。

表1 黔北麻羊DKK1基因的引物序列、退火溫度及目的片段大小

1.6.2 生物信息學(xué)工具 采用Expasy-ProtParam及DNAstar軟件分析編碼產(chǎn)物的理化特性；采用Expasy-ProtScale進(jìn)行疏水性與親水性預(yù)測(cè)；采用SignalP4.1預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；采用Expasy-TMpred和TMHMM2.0在線跨膜蛋白軟件預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；用NetPhos 3.1 Server工具預(yù)測(cè)蛋白磷酸化位點(diǎn)；采用TargetP 1.1 Server工具預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位點(diǎn)；采用PORTER、SWISS-MODEL工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，采用MEGA6.0、DNAMAN軟件分析序列的同源性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔北麻羊DKK1基因的PCR擴(kuò)增效果

D1.DKK1-1 primer; D2.DKK1-2 primer; D34.DKK1-34 primer; M.Marker 2000圖1 黔北麻羊DKK1擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DKK1amplification products of Qianbei Ma Goat

由圖1可知，黔北麻羊DKK1基因PCR擴(kuò)增圖譜的條帶單一、清晰明亮、特異性好，與預(yù)期擴(kuò)增的條帶大小一致，可用于后續(xù)研究。

2.2 黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)的序列比對(duì)

通過(guò)DNAstar和BioEdit軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行手工拼接，并應(yīng)用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder程序?qū)η甭檠駾KK1基因的CDS區(qū)序列進(jìn)行開放閱讀框分析，獲得1條全長(zhǎng)為789 bp的核苷酸序列序列，共編碼262個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG,終止子密碼子為TAA(圖2)。序列比對(duì)結(jié)果結(jié)合測(cè)序峰圖(圖3)分析，篩選出8個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別為第1內(nèi)含子的C1626T位點(diǎn)，第3內(nèi)含子的A3083G位點(diǎn)，編碼區(qū)的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A和T3411C位點(diǎn)。其中，T3271A為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致半胱氨酸(Cys)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，而其他編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)均為同義突變。同義突變雖然不影響編碼的氨基酸序列，但同義突變可引起最小自由能、外顯子拼接和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)等改變，從而導(dǎo)致mRNA影響蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化，進(jìn)而影響其功能。

2.3 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的理化特性 研究結(jié)果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的分子量為 28 349.17 D，分子式為C1197H1907N385O366S25，理論等電點(diǎn)為8.88，有負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)20個(gè)、正電荷殘基 (Arg + Lys)31個(gè)，在280 nm處的消光系數(shù)為15 690，脂肪系數(shù)為61.22，含有20種常見(jiàn)氨基酸。其中，以丙氨酸(Ala)的含量最高，占氨基酸總量的11.1 %；色氨酸(Trp)含量最低，占氨基酸總量的0.4 %。黔北麻羊DKK1基因編碼產(chǎn)物的不穩(wěn)定指數(shù)為42.66，根據(jù)Guruprasad原則該值大于40。表明，此編碼蛋白相對(duì)不穩(wěn)定。

圖2 黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)的核苷酸和編碼氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and coding amino acid in CDS region of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

圖3 黔北麻羊DKK1基因的8個(gè)SNPs突變位點(diǎn)Fig.3 Eight SNPs mutant sites of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.2 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性預(yù)測(cè) 由圖4可知，在黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的多肽鏈氨基酸序列中，以第16位亮氨酸(Leu)的分值最高，為2.778，表明其疏水性最強(qiáng)；第75位賴氨酸(Lys)的分值最低，為-3.067，表明其親水性最強(qiáng)。用Expasy-ProtParam工具預(yù)測(cè)DKK1基因編碼蛋白的親水性平均值為-0.448。整體上看，肽鏈中的親水性氨基酸數(shù)量高于疏水性氨基酸數(shù)量，結(jié)合預(yù)測(cè)的親水性平均值看，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。

正值表示疏水，負(fù)值表示親水The positive is the hydrophobic and the negative the hydrophilicity圖4 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性圖譜Fig.4 Coding protein hydrophobicity and hydrophilicity of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

2.3.3 黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu) 研究結(jié)果表明，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白信號(hào)肽的平均值(S-score)為0.764S>0.5，預(yù)測(cè)該蛋白為分泌蛋白。由圖5看出，DKK1基因的編碼蛋白具有信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)最有可能位于第31～32位氨基酸間；在第15～37位氨基酸間有1個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)，與該蛋白的疏水性區(qū)域基本一致。說(shuō)明，DKK1蛋白可能是一種膜蛋白受體。

2.3.4 蛋白磷酸化與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 研究結(jié)果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)。其中，絲氨酸(Ser)14個(gè)，蘇氨酸(Thr)9個(gè)，酪氨酸(Tyr)2個(gè)。在黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白亞細(xì)胞中，有93.4 %的可能存在于細(xì)胞外，說(shuō)明DKK1蛋白屬分泌型蛋白。

圖5 黔北麻羊DKK1基因的氨基酸序列信號(hào)肽圖譜Fig.5 Signal peptide mapping of amino acid sequence of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

圖6 黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 The tertiary structure of coding protein of Qianbei Ma Goat DKK1 gene

表2 黔北麻羊與8個(gè)物種DKK1氨基酸序列的同源性

注：山羊(XP_005698218.1)，綿羊(XP_011957844.1)，普通牛(NP_001192473.1)，野牛(XP_005904695.1)，馬(NP_001254731.1)，人(NP_036374.1)，豬(NP_001138856.1)，家鼠(NP_034181.2)。

Note：Caprahircus(XP_005698218.1);Ovisaries(XP_011957844.1);Bostaurus(NP_001192473.1);Bosmutus(XP_005904695.1);Equuscaballus(NP_001254731.1);Homosapiens(NP_036374.1);Susscrofa(NP_001138856.1);Musmusculus(NP_034181.2).

2.3.5 黔北麻羊DKK1蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 研究結(jié)果顯示，在黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(H)占9.1 %，β-折疊(E)占11.5 %，無(wú)規(guī)則卷曲(C)占79.4 %。從α-螺旋(H)和β-折疊(E)結(jié)構(gòu)所占比例看，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白屬于mixed型蛋白。該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成(圖6)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致；該編碼蛋白與同源構(gòu)建蛋白模型(SMTL id：3s2k.1.C)擁有94.25 %的相似度，具有較高可信度。

2.3.6 黔北麻羊DKK1氨基酸序列的同源性與系統(tǒng)發(fā)育樹 同源性分析結(jié)果(表2)表明，黔北麻羊DKK1基因的編碼蛋白與普通山羊和綿羊的同源性均較高，分別為99.6 %和98.8 %；與普通牛和野牛次之，分別為93.2 %和92.7 %；與豬和家鼠較低，分別為83.4 %和72.1 %。

由圖7可知，用NJ 法構(gòu)建9個(gè)物種DKK1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹與其生物進(jìn)化的物種樹基本一致，符合物種進(jìn)化規(guī)律。說(shuō)明，該基因較保守。黔北麻羊與家鼠的遺傳距離顯示，不同物種的DKK1基因存在一定差異。

圖7 NJ法構(gòu)建的9個(gè)物種DKK1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of DKK1amino acid sequence of 9 species

3 討 論

Dickkopf-1(DKK1)是一種Wnt信號(hào)通路可溶性胞外抑制劑，前人對(duì)人體DKK1基因的研究多集中在骨質(zhì)疾病、腫瘤及癌癥等方面[6-8]。Tai N等[6]研究表明，DKK1抗體可加快骨形成和增加骨密度，可用于治療骨質(zhì)疏松癥；Forget M A等[7]研究指出，幾種常見(jiàn)癌癥中的DKK1表達(dá)式可作為癌癥預(yù)后預(yù)測(cè)的依據(jù)。對(duì)動(dòng)物DKK1基因的研究主要集中在生物學(xué)功能、機(jī)理研究及生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析方面。Hashimoto H等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，DKK1的表達(dá)量可影響其骨骼發(fā)育，說(shuō)明DKK1基因的表達(dá)量對(duì)動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)有調(diào)控作用，骨骼的發(fā)育可影響動(dòng)物的體尺等生長(zhǎng)性狀，而選育生長(zhǎng)性狀優(yōu)良個(gè)體則能顯著和快速的提高其養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。因此，研究黔北麻羊DKK1基因的SNP位點(diǎn)與其生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，尋找與生長(zhǎng)性狀差異顯著的SNP位點(diǎn)，以提高黔北麻羊的生產(chǎn)性能。Liu等[4]研究表明，豬DKK1基因第二內(nèi)含子G1757A的突變與豬眼肌面積呈顯著差異(P=0.0281)，AG型與GG型差異顯著(P<0.05)；眼肌面積是肉質(zhì)性狀的代表性指標(biāo)之一，與家畜產(chǎn)肉性能有很強(qiáng)的相關(guān)性，且DKK1基因?qū)ωi肉質(zhì)的控制起著重要作用。因此，研究該基因與黔北麻羊肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性，以提高黔北麻羊養(yǎng)殖效益。曹貴玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山羊群體產(chǎn)絨量與其DKK1基因的多態(tài)性有關(guān)，A為優(yōu)勢(shì)等位基因，其對(duì)產(chǎn)絨量有利；而黔北麻羊?qū)儆谌馄ぜ嬗眯蜕窖?，屬粗毛羊品種，其羊毛價(jià)格低，建議今后開展相關(guān)研究。高建斌等[10]研究顯示，不同突變位點(diǎn)不同基因型秦川牛在體尺和肉質(zhì)指標(biāo)中存在不同程度的顯著差異；而黔北麻羊卻缺少相關(guān)研究，建議進(jìn)一步研究黔北麻羊DKK1基因與體尺和肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性，為其優(yōu)良品種選育工作的開展奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

(1)與普通山羊的CDS區(qū)序列比對(duì)結(jié)果顯示，在黔北麻羊DKK1基因的CDS區(qū)序列中有8個(gè)SNP位點(diǎn)，分別為第1內(nèi)含子C1626T位點(diǎn)，第3內(nèi)含子A3083G位點(diǎn)，編碼區(qū)的T3000C、T3228C、T3238C、G3240A、T3271A、T3411C位點(diǎn)。其中，T3271A為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致半胱氨酸(Cys)變?yōu)榻z氨酸(Ser)，而其他編碼區(qū)的SNP位點(diǎn)均為同義突變。

(2)生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，黔北麻羊DKK1基因CDS區(qū)由一條長(zhǎng)789 bp的核苷酸序列構(gòu)成，共編碼262個(gè)氨基酸，蛋白分子量為 28 349.17 D。

(3)DKK1基因編碼蛋白的疏水性與親水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性。信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，DKK1基因的編碼蛋白具有信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)最有可能位于第31～32位氨基酸間；在第15～37位氨基酸間有1個(gè)典型的跨膜螺旋區(qū)。

(4)蛋白磷酸化與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，黔北麻羊DKK1蛋白有25個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有93.4 %的可能存在于細(xì)胞外，說(shuō)明DKK1蛋白是分泌型蛋白。研究結(jié)果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲組成，屬于mixed型蛋白，且三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。DKK1氨基酸序列對(duì)比和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，黔北麻羊DKK1基因編碼蛋白與普通山羊、綿羊和牛等物種均具有較高同源性；NJ法構(gòu)建的黔北麻羊基因系統(tǒng)發(fā)育樹與其生物進(jìn)化的物種樹基本一致。

(5)不同物種的DKK1基因在進(jìn)化上均較保守，有一定程度的遺傳多樣性，并在生物體中影響其多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，因此，該基因可作為動(dòng)物骨骼生長(zhǎng)發(fā)育研究和相關(guān)疾病鑒定的重要候選基因。

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