非洲豬瘟研究進展

商雨 溫國元 趙宗正 張文婷 張騰飛 羅青平 邵華斌

摘要：近些年，非洲豬瘟（African swine fever，ASF）在世界范圍內(nèi)的很多地區(qū)肆虐，每年給全世界的養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失。ASF的防控依舊是個世界性的難題，目前尚無對抗ASF的疫苗和藥物，疫病防控依賴于封鎖隔離。就ASF的病原、臨床癥狀、病毒檢測、流行病學、免疫逃逸和疫苗研發(fā)進展進行了簡要介紹，旨在為ASF的防控提供理論參考。

關鍵詞：非洲豬瘟;臨床癥狀;病毒檢測;流行病學;免疫逃逸;疫苗

中圖分類號：S858.28? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2018）12-0016-03

ASF是豬的一種急性、接觸傳染性和高致死性傳染病，其病原是非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）。ASF每年給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）分為A類疾病以及法定報告動物疫病[1]。依據(jù)《中華人民共和國動物防疫法》，我國將ASF列為一類動物傳染病。現(xiàn)對ASF的研究進展作一綜述，為ASF的防控提供參考。

1? ASF的病原

ASFV屬于非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfarvirus）的惟一成員。病毒粒子具有正二十面體的結(jié)構，直徑約200 nm。位于病毒粒子正中間的是包含病毒基因組的病毒核心，在病毒核心的外圍包裹著一層厚的衣殼。衣殼有三層結(jié)構，在衣殼的兩側(cè)各有一個脂質(zhì)膜，中間為蛋白衣殼[2]。病毒粒子上含有大于50種病毒編碼的蛋白，涉及到病毒基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復、蛋白修飾、病毒入侵和免疫逃逸相關的酶和因子[3]。另外，在病毒粒子上還存在大量的宿主蛋白，其中一些位于囊膜上的宿主蛋白可能與病毒的出芽相關 [3]。病毒的基因組是單股雙鏈線性DNA，長度在170～190 kb范圍內(nèi)，包含151～167個開放閱讀框（Open reading frames，ORFs）[4，5]。

2? ASF的臨床癥狀和剖檢病變

2.1? ASF的臨床癥狀

不同ASFV毒株的毒力強弱不同，感染后引發(fā)的癥狀也有差異，根據(jù)癥狀可以將ASF分為急性型、亞急性型、緩慢型和隱性帶毒型[6]。急性ASF的臨床癥狀為高熱，體溫可升至40.5～42.0 ℃;發(fā)病及死亡率高，病死率可以達到100%;耳、四肢腹背部皮膚有出血點;嘔吐，腹瀉或便秘，糞便帶血。有些最急性的ASF可能不產(chǎn)生任何臨床癥狀而突然死亡。亞急性型和緩慢型ASF臨床癥狀要緩和一些，發(fā)病豬出現(xiàn)虛弱、步態(tài)僵直和不愿站立，精神沉郁，食欲下降，呼吸困難，關節(jié)腫脹、皮膚瘀血及妊娠母豬的流產(chǎn)和死胎等癥狀。隱性帶毒型ASF不表現(xiàn)臨床癥狀，但帶毒豬可以持續(xù)性排出病毒[7]。

2.2? ASF的剖檢病變

ASF的剖檢病變以內(nèi)臟器官出血為主要特征，急性型ASF表現(xiàn)尤為明顯。脾臟顯著性腫大、出血、瘀血、顏色變暗、質(zhì)地變脆易碎;淋巴結(jié)增大、水腫以及出血;心臟和腎臟表面、膀胱皮質(zhì)、膽囊和皮下出血;肝和肺可能出現(xiàn)充血，肺泡和間質(zhì)水腫[7]。

3? ASF病毒的檢測

3.1? 紅細胞吸附試驗（Hemadsorption，HAD）

感染病毒的白細胞可以吸附豬的紅細胞，形成玫瑰花環(huán)樣的結(jié)構，依此來判斷病原的陽性[8，9]。但有少數(shù)毒株的感染不能產(chǎn)生這樣的結(jié)構，因此該方法會造成假陰性。

3.2? 免疫熒光實驗（Immunofluorescence assay，F(xiàn)A）

將淋巴結(jié)、腎、脾、肺等組織器官制作切片或?qū)⒉×辖臃NASFV敏感的細胞系，然后用熒光標記的ASFV抗體染色，通過觀察熒光來檢測是否存在ASFV[10]。

3.3? 抗體檢測

目前市場上尚無有效的對抗ASFV的疫苗，因此血清中ASFV抗體也可以作為病毒感染的指標，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光試驗（Indirect immunofluorescence assay，IFA）或蛋白免疫印跡試驗（Western blot，WB）檢測血清中ASFV抗體，可以判斷是否受到病毒攻擊[11-13]。

3.4? 病毒核酸檢測

聚合酶鏈式反應（PCR）檢測周期短，靈敏度高，特異性好，比較適合用于ASFV的快速檢測[14]。也可以利用多重PCR在一個反應中檢測多重病原，可用于區(qū)別ASFV與其他病原或者多個病原混合感染的診斷[15，16]。熒光定量PCR可以進一步提高檢測的靈敏度和特異性，而且可以減少反應步驟，可計算病毒相對或絕對含量，這個方法也越來越多地應用于ASFV的檢測[17]。但是，上述兩種PCR檢測方法需要相對昂貴的儀器，因此不適合基層和野外的應用。環(huán)介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）可實現(xiàn)在恒溫下對目的基因的擴增，在檢測ASFV中因其操作簡單、特異性好和靈敏度高，越來越受到青睞[18]。

4? ASF的流行病學

ASFV的主要宿主是家豬和野豬，病毒可以通過與感染豬直接接觸來傳播，也可以通過污染的食物、蜱蟲來間接傳播[19]。另外，在一些生物安全防護級別較高的養(yǎng)殖場依然暴發(fā)ASF。有研究表明，ASFV可以在螫蠅體內(nèi)存活3 d，這也意味著這些螫蠅可能是ASFV傳播的另一種昆蟲媒介[20]。

1921年，在肯尼亞第一次發(fā)現(xiàn)ASFV，隨后傳播到非洲其他的國家。1957年，ASFV首次傳到歐洲[21]，隨后在歐洲國家大規(guī)模暴發(fā)，經(jīng)過采取系列措施，ASF得到了很好的控制[22]。2007年，ASF在歐洲的格魯吉亞再次暴發(fā)，隨后傳播到俄羅斯、白俄羅斯和烏克蘭[23]，到2014年蔓延至歐洲東部國家[24]。2018年8月份，在中國首次暴發(fā)ASF疫情，隨后迅速蔓延，多次暴發(fā)[25]。

依據(jù)p72基因的進化分析，可以將ASFV分成24個基因型，即基因I-XXIV。依據(jù)CD2v的序列分析，可將ASFV分為8個血清亞型（1-8亞型）[26]。在非洲主要以I基因型為主要流行基因型，歐洲以II型為主要血清型。中國流行株的血清型為II型，血清亞型為8亞型[25]。

5? ASFV的免疫逃逸

ASFV毒力的強弱可能與病毒逃逸機體免疫的能力相關。有研究表明，強毒感染的過程中可以逃避免疫系統(tǒng)，而弱毒則會激發(fā)炎癥反應和免疫反應的細胞信號通路[27]。在ASFV中有許多基因參與到免疫逃逸中來，如DP71L、A238L、MGF360、MGF505/530、I329L和CD2v等。它們以不同的方式來幫助病毒逃逸免疫系統(tǒng)的清除，如DP71L蛋白抑制病毒感染早期細胞凋亡的啟動[28]，MGF360和MGF505/530抑制干擾素的產(chǎn)生和干擾素的抗病毒效應[29]，A179L抑制細胞自噬[30]以及CD2v蛋白抑制淋巴細胞的產(chǎn)生[31]等。這些不同的逃逸機制可能單獨或協(xié)同發(fā)揮作用，在中斷一條通路時可能會有其他的機制替補上來，使得病毒維持逃避免疫的能力。

6? ASF的疫苗研究

ASFV的強大免疫逃逸能力使得開發(fā)疫苗的難度較大。傳統(tǒng)方法制備滅活疫苗可以產(chǎn)生抗體，但是對于強毒的攻擊不能提供有效的免疫保護[32]。在自然界中，存在一些毒力弱的ASFV毒株，如OURT88/3和NH/P68毒株等，利用這些病毒來開發(fā)弱毒活疫苗也被嘗試。研究表明，弱毒株開發(fā)的減毒活疫苗能夠?qū)SF提供有效的保護，并且不同的免疫組合還能對不同的毒株產(chǎn)生交叉免疫保護。但是弱毒株會對機體產(chǎn)生不同程度的副作用，這對豬的生產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了很大的影響[33]。另外，研究表明ASFV在細胞系上連續(xù)傳代可以使病毒的毒力減弱甚至喪失。但是利用該方法開發(fā)的減毒活疫苗并不能使機體產(chǎn)生對母本強毒的有效抵抗[34]。由此可見，開發(fā)常規(guī)ASF滅活疫苗和弱毒/減毒活疫苗的難度很大。

隨著生物技術的發(fā)展，操作大的病毒DNA已不是難題。利用分子生物學技術敲除ASFV病毒的部分基因，如DP148R，EP402R，MGF360/MGF505和B119L，獲得重組ASFV病毒。重組ASFV在細胞上的復制能力不變，但對宿主動物的致病性大大降低。在實驗條件下，用這些重組病毒免疫宿主動物，可以使宿主產(chǎn)生對抗同基因型強毒的攻擊，但對不同基因型的強毒的攻擊效果差異較大[24，35]。亞單位疫苗是開發(fā)ASF疫苗的另一種嘗試，但單獨使用亞單位疫苗很難促使機體產(chǎn)生有效的免疫保護。有研究表明[36]，用p30亞單位疫苗免疫后，再用減毒ASFV毒株OURT88/3株加強免疫，可以達到很好的免疫效果，而且可以擴大抗原表位的區(qū)域，表明用亞單位疫苗和ASFV減毒株聯(lián)合使用有利于潛在抗原表位的開發(fā)，這為開發(fā)高效，安全和能交叉保護的疫苗增添了一份希望。

7? 小語

近些年，ASF在全世界多個區(qū)域暴發(fā)，范圍有擴大的趨勢。我國在2018年8月發(fā)現(xiàn)第一例ASF，至11月中旬已經(jīng)發(fā)生多起，給我國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來了極大的打擊。目前，市場上尚無ASF疫苗，對ASF的控制主要采取封鎖隔離（即對發(fā)病的豬場進行隔離），對發(fā)病豬場生豬進行撲殺和無害化處理，控制人和動物進出，養(yǎng)殖場和周圍區(qū)域消毒封鎖等措施。了解ASFV的研究進展可以促進對ASF的認識和引起對ASF防控的重視，同時為ASF的防控提供理論依據(jù)。ASF的防控一方面需要政府采取一系列措施對ASFV進行圍追堵截;另一方面還需要出臺系列政策促進養(yǎng)殖業(yè)向綠色、高效、環(huán)保和高生物防護模式轉(zhuǎn)變;要加強對ASF的研究，政府應當適當擴大對ASF疫苗研發(fā)的投入，爭取及早研發(fā)出高效、安全的ASF疫苗。

參考文獻：

[1] 戈勝強，吳曉東，李金明，等.巴西非洲豬瘟根除計劃的經(jīng)驗與借鑒[J].中國獸醫(yī)學報，2017，37（5）：961-964.

[2] 歐云文，馬小元，王? 俊，等.非洲豬瘟分子病原學及分子流行病學研究進展[J].中國獸醫(yī)學報，2018，38（2）：416-420.

[3] ALEJO A，MATAMOROS T，GUERRA M， et al. A proteomic atlas of the African swine fever virus particle[J].Journal of Virology，2018，doi：10.1128/JVI.01293-18.

[4] CHAPMAN D A，TCHEREPANOV V，UPTON C，et al. Comparison of the genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates [J].J Gen Virol，2008，89（2）：397-340.

[5] DE VILLIERS E P， GALLARDO C， ARIAS M，et al. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences [J].Virology，2010，400（1）：128-136.

[6] 劉? 賀.非洲豬瘟診斷技術研究進展[J].動物醫(yī)學進展，2019， 40（7）：1-3.

[7] 羅滿林.動物傳染病學[M].第1版.北京：中國林業(yè)出版社，2013.

[8] SIERRA M A，GOMEZ-VILLAMANDOS J C，CARRASCO L， et al.In vivo study of hemadsorption in African swine fever virus infected cells [J].Veterinary Pathology，1991，28（2）：178-181.

[9] GALINDO I，ALMAZN F，BUSTOS M J，et al. African swine fever virus EP153R open reading frame encodes a glycoprotein involved in the hemadsorption of infected cells[J].Virology，2000，266（2）：340-351

[10] GREGG D A，MEBUS C A，SCHLAFER D H. A comparison of three avidin-biotin complex immunoenzyme systems for detection of African swine fever virus antigen in paraffin-embedded tissues [J].J Vet Diagn Invest，1995，7（1）：17-22.

[11] BERGERON H C，GLAS P S，SCHUMANN K R. Diagnostic specificity of the African swine fever virus antibody detection enzyme-linked immunosorbent assay in feral and domestic pigs in the United States[J].Transbound Emerg Dis，2017，64（6）：1665-1668.

[12] GIMNEZ-LIROLA L G，MUR L，RIVERA B，et al. Detection of African swine fever virus antibodies in serum and oral fluid specimens using a recombinant protein 30 （p30） dual matrix indirect ELISA[J].PLoS One.2016，11（9）：e0161230.

[13] KAZAKOVA A S，IMATDINOV I R，DUBROVSKAYA O A，et al. Recombinant protein p30 for serological diagnosis of African swine fever by immunoblotting assay[J].Transbound Emerg Dis，2017，64（5）：1479-1492.

[14] LUO Y，ATIM S A，SHAO L，et al. Development of an updated PCR assay for detection of African swine fever virus[J].Arch Virol，2017，162（1）：191-199.

[15] ERICKSON A，F(xiàn)ISHER M，F(xiàn)URUKAWA-STOFFER T，et al. A multiplex reverse transcription PCR and automated electronic microarray assay for detection and differentiation of seven viruses affecting swine[J].Transbound Emerg Dis，2018，65（2）：e272-e283.

[16] HU L，LIN X Y，YANG Z X，et al. A multiplex PCR for simultaneous detection of classical swine fever virus，African swine fever virus， highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus， porcine reproductive and respiratory syndrome virus and pseudorabies in swines[J].Pol J Vet Sci，2015，18（4）：715-723.

[17] LIU L，LUO Y，ACCENSI F，et al. Pre-clinical evaluation of a real-time PCR assay on a portable instrument as a possible field diagnostic tool：Experiences from the testing of clinical samples for African and classical wwine fever viruses[J].Transbound Emerg Dis，2017，64（5）：e31-e35.

[18] JAMES H E，EBERT K，MCGONIGLE R，et al. Detection of African swine fever virus by loop-mediated isothermal amplification[J].J Virol Methods，2010，164（1-2）：68-74.

[19] GUINAT C，GOGIN A，BLOME S，et al. Transmission routes of African swine fever virus to domestic pigs：current knowledge and future research directions[J].Vet Rec，2016，178（11）：262-267.

[20] OLESEN A S，HANSEN M F，RASMUSSEN T B，et al. Survival and localization of African swine fever virus in stable flies（Stomoxys calcitrans） after feeding on viremic blood using a membrane feeder [J].Vet Microbiol. 2018，222：25-29.

[21] PENRITH M L，VOSLOO W， JORI F，et al. African swine fever virus eradication in Africa [J].Virus Res，2013，173（1）：228-246.

[22] JIA N，OU Y，PEJSAK Z，et al. Roles of African swine fever virus structural proteins in viral infection[J].J Vet Res，2017，61（2）：135-143.

[23] ROWLANDS R J，MICHAUD V，HEATH L，et al. African swine fever virus isolate，Georgia，2007[J].Emerg Infect Dis，2008，14（12）：1870-1874.

[24] GALLARDO C，SNCHEZ E G，PREZ-NEZ D，et al. African swine fever virus （ASFV） protection mediated by NH/P68 and NH/P68 recombinant live-attenuated viruses[J].Vaccine，2018，36（19）：2694-2704.

[25] GE S，LI J，F(xiàn)AN X，et al. Molecular characterization of African swine fever virus，China，2018[J].Emerg Infect Dis，2018，24（11）：2131-2133.

[26] MALOGOLOVKIN A，BURMAKINA G，TULMAN E R，et al. African swine fever virus CD2v and C-type lectin gene loci mediate serological specificity[J].J Gen Virol，2015，96：866-873.

[27] HERRERA-URIBE J，JIMNEZ-MARN，LACASTA A，et al. Comparative proteomic analysis reveals different responses in porcine lymph nodes to virulent and attenuated homologous African swine fever virus strains [J].Vet Res，2018，49（1）：90.

[28] BARBER C，NETHERTON C，GOATLEY L，et al. Identification of residues within the African swine fever virus DP71L protein required for dephosphorylation of translation initiation factor eIF2α and inhibiting activation of pro-apoptotic CHOP[J].Virology，2017，504：107-113.

[29] AFONSO C L，PICCONE M E，ZAFFUTO K M，et al. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response [J].J Virol，2004，78（4）：1858-1864.

[30] HERNAEZ B，CABEZAS M，MUOZ-MORENO R，et al. A179L，a new viral Bcl2 homolog targeting Beclin 1 autophagy related protein[J].Curr Mol Med，2013，13（2）：305-316.

[31] PREZ-NEZ D，GARCA-URDIALES E，MARTNEZ-BONET M，et al. CD2v Interacts with adaptor protein AP-1 during African swine fever infection[J].PLoS One，2015，10（4）：e0123714.

[32] 王西西，陳? 青，吳映彤，等.非洲豬瘟疫苗研究進展[J].中國動物傳染病學報，2018，26（2）：89-94.

[33] LEIT？魨O A，CARTAXEIRO C，COELHO R，et al. The non-haemadsorbing African swine fever virus isolate ASFV/NH/P68 provides a model for defining the protective anti-virus immune response [J].J Gen Virol，2001，82：513-523.

[34] KRUG P W，HOLINKA L G，O'DONNELL V，et al. The progressive adaptation of a georgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome [J].Journal of Virology，2015，89（4）：2324-2332.

[35] MONTEAGUDO P L，LACASTA A，LPEZ E，et al. BA71ΔCD2：a new recombinant live attenuated African swine fever virus with cross-protective capabilities[J].Journal of Virology，2017，91（21）：e01058-17.

[36] MURGIA M V，MOGLER M，CERTOMA A，et al. Evaluation of an African swine fever （ASF） vaccine strategy incorporating priming with an alphavirus-expressed antigen followed by boosting with attenuated ASF virus[J].Arch Virol，2018，doi：10.1007/s00705-018-4071-8.