預(yù)防性回腸造口聯(lián)合盆腔沖洗引流對(duì)大鼠直腸吻合口愈合的影響＊

謝小平 ，郭儀 ，李現(xiàn)才 ，陳任生 ，朱國(guó)民 ，揭志剛

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，1.胃腸外科；2.病理科，南昌 330006)

直腸吻合口瘺是直腸癌術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重地影響了患者術(shù)后臨床轉(zhuǎn)歸，如何有效地預(yù)防和治療直腸癌術(shù)后吻合口瘺一直為臨床亟待解決的重要課題。預(yù)防性末端回腸造口是目前臨床上用于預(yù)防和治療直腸吻合口瘺的常用方法，研究顯示[1，2]，預(yù)防性末端回腸造口可有效地降低低位直腸癌術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生率和再手術(shù)率；但是，也有學(xué)者[3]認(rèn)為預(yù)防性回腸造口不僅不能預(yù)防直腸吻合口瘺的發(fā)生，而且有可能增加術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)預(yù)防性回腸造口在直腸吻合口愈合中的作用迄今仍有爭(zhēng)議，為此，本課題對(duì)此進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD大鼠36只，鼠齡 8-10 周，體重（220±20）g，購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 注射用戊巴比妥鈉粉針（上海新亞藥業(yè)有限公司），羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所)，Van Gieson染色液（北京索萊寶科技有限公司），醫(yī)用水銀血壓計(jì)（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司），722型分光光度計(jì) （上海光學(xué)儀器廠），光學(xué)顯微鏡 （日本，Olympus），美國(guó)雙杰電子天平（上海壘固儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型 全部大鼠隨機(jī)分為4組，每組15只大鼠，組內(nèi)再按術(shù)后3d、7d和10d處理不同分為3小組，每小組各5只大鼠。全部大鼠術(shù)前禁食12h后稱重，以2%苯巴比妥鈉溶液(60mg/kg)腹腔注射麻醉，腹部剃毛、消毒、鋪巾，取下腹長(zhǎng)約2cm的正中切口進(jìn)入腹腔：⑴觀察組：切斷直腸后用0號(hào)絲線對(duì)端吻合，吻合口旁置自制的雙套管一根，自腹壁引出固定；再距回盲部約2cm切斷小腸，遠(yuǎn)端封閉，近端外置腸造口。⑵腸造口組：方法同上，于吻合口旁注入1ml生理鹽水，不置腹腔引流管。⑶非腸造口組：切斷直腸后吻合。⑷腸瘺組：直腸吻合時(shí)預(yù)留約0.3cm不吻合，次日行回腸造口和放置腹腔引流管沖洗。術(shù)后全部大鼠自由飲水，12h后少量進(jìn)食，術(shù)后1d用生理鹽水負(fù)壓沖洗腹腔雙套管至清亮，每天2次，共3d。

1.2.2 指標(biāo)觀察和方法 觀察大鼠術(shù)后活動(dòng)、精神狀態(tài)、肛門或腸造口排糞、引流管引流通暢等情況，按處理時(shí)間點(diǎn)剖腹，檢查大鼠腹腔粘連和吻合口愈合程度，切取吻合口兩側(cè)約3cm腸襻，剪除周圍粘連脂肪組織，清洗后，一端腸管用絲線結(jié)扎，另一端插入無針頭的頭皮針導(dǎo)管并結(jié)扎，與去除袖帶的血壓計(jì)氣管相連，腸襻置于生理鹽水中，緩慢充氣，若見水中氣泡，記下水銀柱刻度即為吻合口破裂壓。切取術(shù)后3d、7d和10d各處理時(shí)間點(diǎn)大鼠腸吻合口及1cm的腸襻，置-60℃保存。按羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒說明書操作，精確稱取吻合口腸壁100mg，剪碎，勻漿，加入堿水解液、水浴，調(diào)節(jié)pH值至 6.8，加入蒸餾水至4ml和活性炭，以3500r/min離心，取上清液1ml為實(shí)驗(yàn)液，以蒸餾水為空白管、5μg/ml標(biāo)準(zhǔn)羥脯氨酸液為標(biāo)準(zhǔn)管，分別依次加入氯胺T、過氯酸和對(duì)二甲胺基苯甲酸各0.5ml，混勻、置 60℃水浴 15min后，離心，分別取上清液于550nm處，1cm光徑，測(cè)各管OD值。按公式計(jì)算組織羥脯氨酸含量：羥脯氨酸含量（μg/mg濕重）=（實(shí)驗(yàn)管OD值-空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管 OD 值）×標(biāo)準(zhǔn)品含量 （5μg/ml）×水解液體積(ml)/組織濕重（mg）。⑷病理學(xué)檢查 切取吻合口組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察吻合口組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況；另取石蠟切片，采用Van Gieson染色法[4]行膠原染色，光鏡下觀察并拍照，觀察組織膠原纖維含量和分布。染色判斷：膠原纖維呈鮮紅色，肌纖維和紅細(xì)胞為黃色，細(xì)胞核為藍(lán)黑或灰色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全部數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計(jì)量資料采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用 Student檢驗(yàn)，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 60只大鼠術(shù)后死亡3只，其中，觀察組1只，死于手術(shù)當(dāng)日下午，腸瘺組2只，術(shù)后次日發(fā)現(xiàn)死亡，死亡原因可能與麻醉和手術(shù)創(chuàng)傷有關(guān)；死亡大鼠及時(shí)補(bǔ)做。其余大鼠均成活，進(jìn)食、飲水正常、精神靈敏、活躍；術(shù)后2h小腸造口或肛門開始排糞；引流管沖洗通暢；術(shù)后3d、7d、10d剖腹，觀察組、腸造口組及腸瘺組腹腔及吻合口旁粘連明顯，非腸造口組腹腔粘連較輕，無積液。

2.2 吻合口破裂壓的變化 術(shù)后各組隨時(shí)間延長(zhǎng)吻合口破裂壓均逐漸增加（P<0.05）；而在術(shù)后3d、7d、10d，觀察組的吻合口破裂壓雖高于腸造口組和非腸造口組，但兩者比較并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），但明顯高于腸瘺組(P<0.05)。見表1。

表1 術(shù)后各組吻合口破裂壓的變化（x±s，mmHg）

2.3 組織羥脯氨酸含量的變化 術(shù)后各組吻合口組織羥脯氨酸的含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加 （P<0.05）；而在術(shù)后 3d、7d、10d，觀察組組織羥脯氨酸含量分別與腸造口組和非腸造口組比較均無明顯差異（P>0.05），但較腸瘺組明顯升高（P<0.05）。

表2 術(shù)后各組腸吻合口的組織羥脯氨酸含量變化（x±s，μg/g）

2.4 病理變化 光鏡下觀察，術(shù)后3d，各組黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較多，其中，腸瘺組明顯，其次為非腸造口組和腸造口組，觀察組最少；術(shù)后7d各組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，但是，腸瘺組仍較多，而至術(shù)后10d，各組基本上無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Van Gieson膠原染色顯示：術(shù)后3d，各組染色膠原較少，其中，腸瘺組染色膠原稀疏；而至術(shù)后7d和10d，各組染色膠原逐漸增加，觀察組染色膠原增多，其次為腸造口組和非腸造口組，而腸瘺組最少，且分布較雜亂（見圖1）。

圖1 紅色為膠原纖維，藍(lán)色為炎癥細(xì)胞

3 討論

保肛手術(shù)是低位直腸癌根治性手術(shù)患者的迫切要求，但是，術(shù)后較高的直腸吻合口瘺的發(fā)生率是一直困擾臨床的難題之一[5]。自2007年瑞典學(xué)者M(jìn)atthiessen P等[6]首次報(bào)告預(yù)防性腸造口可以有效地降低低位直腸癌術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生率以來，預(yù)防性腸造口術(shù)已在臨床上被廣泛應(yīng)用，但是，對(duì)其預(yù)防術(shù)后直腸吻合口瘺的作用也一直存在爭(zhēng)議[7-11]。有研究[12，13]認(rèn)為預(yù)防性腸造口能明顯降低高危人群直腸吻合口瘺的發(fā)生率和再手術(shù)率以及吻合口瘺相關(guān)的死亡率，但也有研究[7]認(rèn)為預(yù)防性腸造口不僅不能降低術(shù)后直腸吻合口瘺的發(fā)生率，反而會(huì)延緩了患者術(shù)后康復(fù)，增加了術(shù)后腸梗阻、腹腔感染和腸穿孔等并發(fā)癥的發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)：60只大鼠除術(shù)后3只發(fā)生與手術(shù)相關(guān)的死亡外，其余成活的大鼠中，除腸瘺組外，另外3組大鼠均無一例出現(xiàn)吻合口瘺，但是，觀察組、腸造口組及腸瘺組大鼠術(shù)后腹腔及吻合口處小腸和網(wǎng)膜粘連致密，而非腸造口組腹腔粘連較輕，提示：預(yù)防性回腸造口有增加大鼠術(shù)后腹腔粘連及腸梗阻的風(fēng)險(xiǎn)。

腸吻合口的愈合涉及到腸黏膜上皮細(xì)胞遷移和分化、新生血管的生成和基質(zhì)膠原合成等多個(gè)環(huán)節(jié)，其中，膠原合成量在腸吻合口愈合中起重要作用。腸吻合口的膠原主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原，并經(jīng)膠原酶和明膠酶作用降解；研究表明[14]：腸吻合后3h即開始合成膠原，并逐漸增加，至第4周恢復(fù)正常，并同時(shí)伴隨有膠原的降解。腸吻合口愈合的強(qiáng)度則取決于膠原合成和降解的平衡；腸吻合口破裂壓則是評(píng)估吻合口愈合強(qiáng)度的重要指標(biāo)，而測(cè)定組織羥脯氨酸的含量可反映組織愈合過程中膠原合成情況[15]。研究表明：腹腔感染是影響腸吻合口羥脯氨酸合成的重要因素。Thornton等[16]研究發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組比較，腹腔感染后大鼠，結(jié)腸吻合口于術(shù)后24h膠原合成量明顯下降，96h后恢復(fù)正常。本研究發(fā)現(xiàn)：各組大鼠隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，腸吻合口破裂壓也逐漸增加，但腸瘺組的吻合口破裂壓始終低于其它3組（P<0.05），其組織羥脯氨酸含量也相應(yīng)地明顯降低（P<0.05）；觀察組的吻合口破裂壓分別與腸造口組和非腸造口組比較并無顯著差異（P>0.05），并且，其組織羥脯氨酸含量也較腸造口組和非腸造口組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），其原因可能為腸吻合口瘺引起腹腔嚴(yán)重感染，抑制了吻合口組織羥脯氨酸的合成[17，18]，致使吻合口組織愈合延遲；而預(yù)防性回腸造口術(shù)后早期轉(zhuǎn)流糞水及減輕吻合口腸腔張力，減輕了局部感染，有利于組織膠原的合成和分泌[16-19]。非腸造口組盡管術(shù)后早期吻合口有糞水聚積誘發(fā)吻合口炎的風(fēng)險(xiǎn)，但是，其炎癥反應(yīng)程度較輕，吻合口膠原的合成可能并未被抑制，致使其吻合口破裂壓與腸造口組比較并無明顯差異，提示，術(shù)中預(yù)防性腸造口相對(duì)于非保護(hù)性腸造口可能在預(yù)防直腸吻合術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生方面并無明顯優(yōu)勢(shì)。

本研究光鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)，術(shù)后3d，各組大鼠腸吻合口均存在不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中，腸瘺組的黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)最多，其次為非腸造口組、腸造口組，觀察組最少；但是，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，各組大鼠吻合口炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度也逐漸減輕，至術(shù)后10d，各組基本恢復(fù)正常；采用Van Gieson染色法對(duì)各組大鼠吻合口組織膠原染色研究顯示，隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，吻合口膠原的含量也逐漸增多；在術(shù)后3d，各組吻合口膠原含量均較少，而至術(shù)后7d和10d，觀察組的膠原含量最多，腸瘺組最少，并且，膠原分布較雜亂或呈束狀；這些病理變化說明，吻合口組織的炎性反應(yīng)程度可能是影響組織膠原合成和分泌的重要因素，采用預(yù)防性腸造口雖然有可能減輕直腸吻合口的炎癥反應(yīng)，但是相對(duì)于非腸造口的大鼠，并不能預(yù)防術(shù)后吻合口瘺的發(fā)生，反而有增加了術(shù)后腹腔粘連的風(fēng)險(xiǎn)[20]，提示直腸吻合口瘺的發(fā)生可能還與其它的病理因素有關(guān)。