自噬在胰腺癌發(fā)生及治療中的作用研究進(jìn)展

侍書成，楊波

（蘇州大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝膽外科，江蘇常州213003）

自噬是真核細(xì)胞降解細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器的過程，具有廣泛的生物學(xué)作用。作為細(xì)胞內(nèi)的一種自我防御機(jī)制，自噬可通過調(diào)節(jié)能量代謝和蛋白質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)量控制等方式穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和維持細(xì)胞正常功能。自噬的異常與感染、免疫、衰老、腫瘤、神經(jīng)變性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其中，自噬與腫瘤的關(guān)系備受關(guān)注。自噬在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，既可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，又可促進(jìn)其發(fā)生和發(fā)展。本文就自噬及其與胰腺癌之間關(guān)系的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　自噬的分類與過程

自從1963年Deter和De Duve［1］首次提出自噬這一概念以來，自噬的發(fā)生機(jī)制已得到大量研究闡明。按照發(fā)生過程的不同，自噬可分為巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。巨自噬是最常見也是最主要的自噬形式。通常認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是自噬體膜的重要來源，電子斷層掃描已證實(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與自噬體之間存在關(guān)聯(lián)［2］。也有研究認(rèn)為線粒體、細(xì)胞膜、核膜、高爾基體等是自噬體膜的來源。但是由于這些結(jié)構(gòu)形成自噬體過程中缺乏特異性的蛋白標(biāo)志物，使得自噬體膜的來源問題仍未明確［3］。

自噬起始階段，在起始信號(hào)如饑餓、缺氧刺激下，調(diào)控自噬的中心分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）活性受到抑制，mTOR對(duì) Unc-51樣激酶（Unc-51-like kinase 1，ULK1）的磷酸化作用減弱，使ULK1激活并進(jìn)一步活化 ULK 1復(fù)合體——ULK 1／2-Atg13-FIP200-Atg101。隨后ULK1復(fù)合體從細(xì)胞質(zhì)定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特定部位進(jìn)而募集VPS 34復(fù)合體，VPS 34通過磷酸化磷脂酰肌醇產(chǎn)生1，2-棕櫚酰磷脂酰肌醇-3-磷酸（phosphatidylinositol-3-phosphate，PI3P）。PI3P是構(gòu)成自噬體膜的基礎(chǔ)，可組裝一些含有FYVE和PX結(jié)構(gòu)域的蛋白或自噬相關(guān)蛋白Atg至自噬體形成部位，啟動(dòng)自噬體的形成過程。自噬過程中，VPS 34結(jié)合VPS 15而被激活并組成VPS 34復(fù)合體的核心，此時(shí)Beclin1從Beclin1／Bcl2復(fù)合體中的非激活狀態(tài)解離為激活狀態(tài)，參與組成VPS 34復(fù)合體。Beclin1可進(jìn)一步募集Atg 14和抗紫外線輻射相關(guān)基 因 （UV irradiation resistance-associated gene，UVRAG）蛋白至 VPS 34復(fù)合體［4］，促進(jìn)自噬體的形成、成熟和運(yùn)輸。而 VMP 1，Ambra-1，Bif-1，Rubicon等也可參與構(gòu)成VPS 34復(fù)合體，對(duì)自噬體的形成起正性或負(fù)性調(diào)節(jié)作用。此外，當(dāng)細(xì)胞處于低ATP狀態(tài)時(shí)，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）也可感受胞內(nèi)AMP水平，通過磷酸化激活 TSC1／TSC2（tuberous sclerosis complex proteins）復(fù)合體來抑制mTOR或直接磷酸化ULK 1促進(jìn)自噬［5］。

在自噬體延長階段，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）起到了關(guān)鍵作用。細(xì)胞中LC3前體經(jīng)Atg4切割顯露出C末端甘氨酸殘基形成LC3-Ⅰ，隨后LC3-Ⅰ再經(jīng)Atg7和Atg3活化，在Atg5-Atg12-Atg16L1組成的Atg16復(fù)合體作用下形成具有膜結(jié)合力的LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ是自噬中特異性最強(qiáng)的標(biāo)志物，在Atg16復(fù)合體與LC3-Ⅱ的協(xié)助下，自噬體膜泡延長、包裹待降解內(nèi)容物直至形成閉合的含雙層膜結(jié)構(gòu)的成熟膜泡。最后自噬體運(yùn)輸至溶酶體，在溶酶體中水解酶的作用下降解包裹的內(nèi)容物。

2　胰腺癌中自噬的上調(diào)及其意義

Réz等［6］在 1999年首次報(bào)道胰腺癌中的自噬現(xiàn)象。他們在藥物誘導(dǎo)的胰腺癌動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，在正常腺泡上皮向非典型腺泡上皮轉(zhuǎn)變過程中自噬活動(dòng)也逐漸增加。隨后的一個(gè)對(duì)71例胰腺癌患者的回顧性研究中，免疫組化檢測結(jié)果顯示自噬相關(guān)蛋白LC3在未接受化療的胰腺癌患者癌組織周邊顯著增加，且LC3表達(dá)增加與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［7］。胰腺癌中LC3的上調(diào)標(biāo)志著自噬激活，且自噬是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)過程。LC3的上調(diào)可以理解成自噬流的活化，也可能是自噬的后半進(jìn)程（如自噬溶酶體降解）受阻的表現(xiàn)，所以單從LC3水平推測自噬活性并不能明確兩者間功能相關(guān)性。Yang等［8］采用GFP-LC3標(biāo)記法和免疫組化染色法，發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞系中LC3-Ⅱ和自噬相關(guān)蛋白Atg7的表達(dá)明顯高于正常胰腺導(dǎo)管細(xì)胞。進(jìn)一步用電子顯微鏡也觀察到胰腺癌細(xì)胞中自噬體與溶酶體的融合過程。與單純檢測個(gè)別自噬相關(guān)標(biāo)志相比，通過多種標(biāo)志物及檢測方法來檢測自噬水平，能更準(zhǔn)確反映細(xì)胞內(nèi)自噬的動(dòng)態(tài)激活。他們還發(fā)現(xiàn)胰腺癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)和浸潤的神經(jīng)纖維中也存在高強(qiáng)度LC3染色。以上研究提示異常的自噬參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，甚至腫瘤的轉(zhuǎn)移，并可能影響胰腺癌的預(yù)后。

3　單純抑制自噬與胰腺癌的關(guān)系

Kim等［9］研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)缺乏狀態(tài)可通過抑制mTOR誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細(xì)胞自噬水平的升高，當(dāng)用自噬抑制劑氯喹（抑制自噬溶酶體的降解）或渥曼青霉素（抑制自噬體的形成）抑制自噬后，胰腺癌細(xì)胞的存活率降低。同時(shí)，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)經(jīng)氯喹與渥曼青霉素處理后，腫瘤細(xì)胞中caspase-3和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶顯著升高，且caspase抑制劑Z-VAD可部分抑制氯喹與渥曼青霉素引起的細(xì)胞死亡。這些證據(jù)表明，自噬可作為一種細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)，通過抗凋亡機(jī)制促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞存活。氯喹與渥曼青霉素可通過抑制自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。其他研究也表明抑制自噬可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如特異性的神經(jīng)元敲除Atg5或Atg7，可引起小鼠神經(jīng)元退化和凋亡［10］。

Yang等［8］研究發(fā)現(xiàn)氯喹或Atg5 siRNA阻斷自噬后，胰腺癌細(xì)胞內(nèi)氧消耗和氧化磷酸化水平降低，細(xì)胞增殖受到抑制，與之伴隨發(fā)生的是細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高以及DNA雙鏈斷裂片段增多。而ROS抑制劑（抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸）可明顯降低胰腺癌細(xì)胞內(nèi)的自噬水平和部分減輕因自噬抑制造成的腫瘤細(xì)胞的增殖抑制。這提示自噬可通過抑制胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，維持細(xì)胞內(nèi)DNA的穩(wěn)定，從而起到對(duì)腫瘤的保護(hù)作用。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)自噬可提供三羧酸循環(huán)所需的中間代謝物，從而維持細(xì)胞內(nèi)能量代謝平衡。

自噬可通過抑制凋亡、減少ROS生成來維持基因組穩(wěn)定和能量代謝平衡以促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，通過抑制自噬來影響腫瘤生物學(xué)行為的研究也逐漸成為抗胰腺癌治療的熱點(diǎn)。其中關(guān)于自噬抑制劑氯喹及其類似物羥氯喹的研究較為突出。但Wolpin等［11］的研究顯示，羥氯喹單藥治療胰腺癌并不能達(dá)到普遍的自噬抑制效果，因此認(rèn)為單獨(dú)抑制自噬或許不足以抑制人體胰腺癌的生長。

此外，自噬在腫瘤中扮演的角色，不僅取決于腫瘤的類型和發(fā)展階段，還取決于腫瘤的基因譜。胰腺癌的發(fā)展往往伴隨基因突變，其中Kras突變出現(xiàn)在幾乎100%的胰腺癌中，約75%的胰腺癌伴有p53缺失或突變［12－13］。Rosenfeldt等［12］對(duì)基因工程小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠胰腺Kras突變（G12D位點(diǎn)突變，KrasG12D／＋）誘導(dǎo)了自發(fā)性癌前損害——Pan-INs。隨著時(shí)間的推移，PanIN經(jīng)歷PanIN-2、PanIN-3逐步發(fā)展至胰腺癌。然而當(dāng)敲除自噬相關(guān)基因Atg 7或Atg 5時(shí)，小鼠只發(fā)生PanIN-1和少量的PanIN-2，而形成PanIN-3和胰腺癌的過程卻受到阻礙。這表明Kras突變（p53正常）誘導(dǎo)發(fā)生的胰腺癌需要自噬的參與。然而構(gòu)建 KrasG12D／＋、p53－／－小鼠模型發(fā)現(xiàn)，敲除Atg 7組的小鼠死亡時(shí)間明顯快于未敲除組，而且Atg7的缺失加快了腫瘤形成。因此，胰腺癌的發(fā)展過程中，自噬所起的作用受到p53基因的調(diào)節(jié)：當(dāng)胰腺癌中p53未發(fā)生缺失或突變時(shí)，自噬促進(jìn)腫瘤發(fā)展，而當(dāng)p53發(fā)生缺失或突變，自噬抑制腫瘤的發(fā)展。與Yang等［8］的研究結(jié)果不同，Rosenfeldt等［12］采用羥氯喹處理Ras誘導(dǎo)的p53缺失胰腺癌小鼠時(shí)，羥氯喹不但未顯示腫瘤抑制作用，反而加快了腫瘤的生長并明顯縮短了小鼠生存期。所以，應(yīng)用羥氯喹時(shí)應(yīng)重視腫瘤基因突變譜，尤其伴有p53突變的腫瘤，其抗腫瘤效應(yīng)尚待進(jìn)一步研究。雖然Rosenfeldt等［12］對(duì)氯喹或羥氯喹應(yīng)用于臨床的安全性提出了質(zhì)疑，但是Yang等［14］認(rèn)為在眾多腫瘤發(fā)展過程中，野生型p53等位基因的雜合性缺失（而不是純合性缺失）誘導(dǎo)了胰腺癌的發(fā)生。他們在體外培養(yǎng)3種不同 p53基因型 （p53＋／－，p53－／－和p53R172H／＋）的小鼠胰腺癌細(xì)胞系，當(dāng)通過敲除Atg5或采用氯喹抑制自噬時(shí)，這3種細(xì)胞系的克隆均受到抑制，即無論p53是否發(fā)生突變或缺失，抑制自噬對(duì)腫瘤的生長均起到抑制作用。更重要的是，羥氯喹還可有效抑制小鼠體內(nèi)人胰腺癌移植瘤的生長，而這些移植瘤均伴有Kras和p53突變。這種矛盾的研究結(jié)論可能是由二者運(yùn)用的小鼠模型不同造成，所以建立的動(dòng)物模型不同會(huì)影響研究結(jié)果。

4　自噬與胰腺癌化療

許多化療藥物可提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)的自噬水平，其機(jī)制可能包括：通過激活p53，繼而增加自噬相關(guān)蛋白（如 AMPK，DAPK1，TSC2，ULK1／2）表達(dá)以促進(jìn)自噬活性［15］；通過增加 Beclin-1、VMP1的表達(dá)或促進(jìn)Vps34的激活以誘導(dǎo)自噬發(fā)生［16］。根據(jù)細(xì)胞類型的不同，具體作用機(jī)制也存在差異。自噬水平的升高既能促進(jìn)也能拮抗化療藥物的抗腫瘤作用。在胰腺癌的化療實(shí)驗(yàn)中也存在類似的現(xiàn)象。

4.1　自噬促進(jìn)化療藥物的抗胰腺癌作用

Mukubou等［17］用吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)自噬水平提高，當(dāng)吉西他濱聯(lián)合放療后，自噬水平得到進(jìn)一步提高。當(dāng)用低劑量3-甲基腺嘌呤短時(shí)間處理胰腺癌細(xì)胞時(shí)，既能有效抑制自噬，又不會(huì)影響腫瘤細(xì)胞增殖。在用該劑量的3-甲基腺嘌呤聯(lián)合吉西他濱處理胰腺癌細(xì)胞時(shí)，吉西他濱的IC50升高，表明抑制自噬能減弱吉西他濱的抗腫瘤作用。Pardo等［18］也證實(shí)，吉西他濱可以通過VMP1上調(diào)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)自噬而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，當(dāng)用3-甲基腺嘌呤抑制自噬后，吉西他濱的促凋亡作用明顯減弱。Fiorini等［19］發(fā)現(xiàn)豹蛙酶（onconase）可通過 Beclin-1提高胰腺癌細(xì)胞內(nèi)自噬水平，從而誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡和生長抑制，氯喹和3-甲基腺嘌呤可明顯減弱豹蛙酶的促凋亡和生長抑制作用。而豹蛙酶誘導(dǎo)自噬的同時(shí)增加了細(xì)胞內(nèi)ROS生成，與Yang等［8］的研究結(jié)果不同，升高的ROS卻可通過激活A(yù)kt／mTOR通路對(duì)自噬產(chǎn)生拮抗作用，從而逃避豹蛙酶誘導(dǎo)的自噬性死亡。更重要的是，豹蛙酶和吉西他濱聯(lián)合應(yīng)用可明顯增強(qiáng)吉西他濱的促凋亡和生長抑制作用，且聯(lián)合用藥可減少吉西他濱的劑量及其導(dǎo)致的毒副反應(yīng)。

雖然大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示，單純應(yīng)用自噬抑制劑（氯喹、羥氯喹或3-甲基腺嘌呤）可抑制胰腺癌的生長［8－9，14］，但當(dāng)抗腫瘤藥物引起腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平進(jìn)一步升高時(shí)，此時(shí)抑制自噬卻可促進(jìn)腫瘤的存活［17－19］。所以可認(rèn)為胰腺癌細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)水平的自噬較正常胰腺細(xì)胞高，對(duì)于腫瘤細(xì)胞來說，其已適應(yīng)該水平的自噬，且該水平的自噬可通過提供營養(yǎng)物質(zhì)和能量維持腫瘤生長，但是當(dāng)受到化療藥物等應(yīng)激刺激時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生更高水平的自噬作為對(duì)應(yīng)激刺激的初級(jí)應(yīng)答，隨后過度激活的自噬可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡。

4.2　自噬抑制化療藥物的抗胰腺癌作用

化療藥物誘導(dǎo)的自噬既可觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡，也可作為腫瘤細(xì)胞抗凋亡的促生存機(jī)制。Hashimoto等［20］發(fā)現(xiàn)吉西他濱和5-氟尿嘧啶在抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的同時(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高，氯喹可明顯增強(qiáng)吉西他濱或5-氟尿嘧啶對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用。他們認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)激活的自噬作為對(duì)化療藥物的防御機(jī)制起到了細(xì)胞保護(hù)作用，而不是促凋亡作用。另外，腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞的殘留增加了腫瘤治療后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，且胰腺癌中腫瘤干細(xì)胞含量增多與腫瘤的化療抵抗、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)［21－22］。除了胰腺癌細(xì)胞，胰腺癌干細(xì)胞中自噬水平也顯著升高，這有助于腫瘤干細(xì)胞在缺氧環(huán)境中的存活［23］。Yang等［24］發(fā)現(xiàn)用基因敲除或氯喹等手段抑制自噬后，胰腺癌腫瘤干細(xì)胞和胰腺癌細(xì)胞的生長均受到明顯抑制，小鼠體內(nèi)移植瘤生長也明顯被抑制。這表明與胰腺癌細(xì)胞相似，腫瘤干細(xì)胞同樣需要自噬維持自身的活動(dòng)。更重要的是，當(dāng)用氯喹或基因敲除抑制自噬后，吉西他濱對(duì)腫瘤干細(xì)胞及小鼠體內(nèi)移植瘤的生長抑制作用明顯增強(qiáng)。

然而，氯喹也可通過非自噬依賴性通路對(duì)腫瘤干細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。趨化因子C-X-C chemokine ligand 12（CXCL12）及其受體CXCR4組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［25］。胰腺癌中CXCL12／CXCR4通路扮演著重要的角色，CXCR4表達(dá)陽性的上皮性腫瘤干細(xì)胞可順濃度梯度遷移至CXCL12高表達(dá)的器官（如肺、骨、肝臟等）［26］。Hedgehog信號(hào)通路在維持腫瘤干細(xì)胞自我更新、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［27］。Balic等［28］的實(shí)驗(yàn)顯示，低濃度氯喹可抑制胰腺癌細(xì)胞系的自噬，但是對(duì)腫瘤干細(xì)胞的自噬無明顯影響。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，氯喹可同時(shí)減少細(xì)胞膜表面CXCR4的表達(dá)和Hedgehog通路中PTCH、SMO、GLI1等蛋白的表達(dá)，從而抑制 CXCL12／CXCR4和 Hedgehog兩條通路介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及其在肝臟的定植。對(duì)乳腺癌和結(jié)腸癌的研究顯示，自噬可拮抗5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯作用，氯喹可通過激活抑癌基因p53及其下游基因p21、p27而誘導(dǎo)G1期細(xì)胞周期阻滯，從而增強(qiáng) 5-氟尿嘧啶的抗腫瘤作用［29－30］。由此可見，不同藥物可通過不同機(jī)制上調(diào)細(xì)胞內(nèi)自噬，而自噬又可通過不同機(jī)制對(duì)藥物起反作用。

5　結(jié)論與展望

自噬在胰腺癌發(fā)展及治療中扮演著復(fù)雜的角色，盡管單純抑制自噬可抑制胰腺癌細(xì)胞生長，但當(dāng)自噬抑制劑聯(lián)合化療藥物抗腫瘤時(shí)，卻產(chǎn)生了相反的作用。這種現(xiàn)象與自噬抑制劑的非特異性作用及其與化療藥物的不同作用機(jī)制有關(guān)。所以，探索自噬特異性抑制劑并闡明其與其他抗腫瘤藥物在胰腺癌中的相互作用機(jī)制，將為胰腺癌的臨床治療提供新的方法及思路。

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