CXCL10、CXCR3及T細胞亞群在進展期白癜風(fēng)患者外周血中的表達及復(fù)方中藥對其影響*

鄧 莉,江 雪,王禹毅,史丙俊,劉 洋,徐 偉,刁慶春,鄭文豪△

(1.重慶市中醫(yī)院/重慶市第一人民醫(yī)院皮膚科 400000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，四川瀘州 646000)

白癜風(fēng)是一種獲得性皮膚病，以黑素細胞漸進性和選擇性破壞為特征[1]。有研究認為白癜風(fēng)是一種器官特異性自身免疫性皮膚病，是由細胞毒性T細胞介導(dǎo)對表皮中黑素細胞攻擊導(dǎo)致的疾病[2]。趨化因子配體10(CXCL10)是趨化因子(CXC)亞家族成員，通過與趨化因子受體3(CXCR3)結(jié)合參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病，如自身免疫性甲狀腺疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腎炎、皮肌炎、銀屑病、紅斑狼瘡等。最近也有越來越多的研究顯示，白癜風(fēng)的發(fā)病與血清中CXCL10的表達水平相關(guān)。同時也有研究認為T細胞依賴的免疫應(yīng)答參與白癜風(fēng)的發(fā)病及發(fā)展過程，尤其是CD8+T細胞，被認為可以直接破壞黑素細胞[3]，而輔助性T細胞(Th細胞)，大部分為CD4+T細胞，可以調(diào)節(jié)或協(xié)助免疫反應(yīng)，促進白癜風(fēng)皮損的好轉(zhuǎn)[4]。本研究所用的復(fù)方中藥是重慶市中醫(yī)院自主研發(fā)的純中藥制劑，已在臨床上廣泛使用，臨床療效肯定,但其治療作用機制仍不明確，因此本研究檢測白癜風(fēng)患者口服該復(fù)方中藥治療前后外周血中CXCL10、CXCR3及T細胞亞群的變化，探討復(fù)方中藥對白癜風(fēng)發(fā)病的免疫調(diào)控作用及機制。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2016年10月在重慶市中醫(yī)院皮膚科就診白癜風(fēng)患者28例，其中男16例，女12例；年齡18～60歲，平均(39.50±12.52)歲；病程1個月至20年；皮損面積1%～5%，平均(3.13±0.86)%，均為進展期。上述28例患者治療前后采血，另選30例健康體檢者作為健康對照組，其中男14例，女16例；年齡18～60歲，平均(33.46±8.62)歲；均無免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病史。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合白癜風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)；根據(jù)“白癜風(fēng)診療共識2014版”“2012年白癜風(fēng)全球問題共識”分類標(biāo)準(zhǔn)，進行診斷及分型；(2)符合進展期；(3)皮損VIDA評分：>1～<4分；(4)近1個月未用過抗白癜風(fēng)藥物治療，未用過免疫調(diào)節(jié)劑，未用過抗白癜風(fēng)物理治療；(5)2周內(nèi)無外用皮質(zhì)類固醇藥物史，皮損無明顯感染征象。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)近1個月使用激素及免疫調(diào)解劑、中藥制劑、光療患者；(2)伴有濕疹、特應(yīng)性皮炎、銀屑病等其他皮膚病患者；(3)惡性腫瘤患者，妊娠或哺乳期婦女；(4)合并自身免疫性疾病患者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2實驗試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone)，人淋巴細胞分離液(上海拜力生物科技有限公司)，CXCL10 ELISA試劑盒(美國RD公司)，人CXCR3 ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特公司)，酶標(biāo)儀(芬蘭產(chǎn)全波長酶標(biāo)儀 Multiskan Spectrum)。CD3-PE,CD8-APC,CD4-FITC(美國BD公司)。流式細胞儀為BD Accuri C6小型流式細胞儀。

1.3方法

1.3.1用藥 口服該中藥復(fù)方(主要由黃芪、白術(shù)、川芎、合歡皮、蒺藜、鉤藤、浮萍、防風(fēng)、白芷、桑枝、丹參、郁金、補骨脂、雞血藤、首烏、女貞子、旱蓮草組成，可酌情加減)，每天1劑，每次200 mL，分3次服用，療程1個月。觀察療效及不良反應(yīng)，拍照留存。安全性評價：試驗組患者治療前及治療1月后均查肝腎功、血、尿、大便常規(guī)。

1.3.2標(biāo)本收集 所有受試者均于治療前后清晨抽取空腹外周靜脈血10 mL 于真空采血管，取2 mL 3 000 r/min 離心5 min，分離收集上層血清，-80 ℃ 保存。另8 mL用于分離外周血單個核細胞，敷抗，固定后上機檢測。

1.3.3CXCL10及CXCR3檢測方法 血清CXCL10和CXCR3水平均采用ELISA試劑盒進行測定，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。在酶標(biāo)儀450 nm處測定各孔吸光度(A)值，分析各細胞因子表達水平。樣品敷抗固定后于1周內(nèi)用流式細胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1外周血清CXCL10及CXCR3檢測結(jié)果 白癜風(fēng)患者治療前外周血清中CXCL10的表達水平明顯較健康對照組高(P<0.01)，治療后較治療前下降(P<0.05)。白癜風(fēng)患者治療前外周血清中CXCR3水平較健康對照組明顯升高(P<0.01)，治療后仍明顯高于健康對照組(P<0.01)，治療后CXCR3水平較治療前無明顯變化(P>0.05)，見表1、圖1。

2.2復(fù)方中藥對外周血T細胞亞群的影響 白癜風(fēng)患者治療前外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞比例低于健康對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，CD4+/CD8+比值升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；服用復(fù)方中藥1個月后，CD3+CD4+T細胞比例較治療前升高(P<0.05)， CD3+CD8+T細胞比例較治療前顯著升高(P<0.01)，CD4+/CD8+比值較用藥前下降(P>0.05)，見表2、圖2。

表1 白癜風(fēng)患者治療前、后及健康對照組外周血清CXCL10及CXCR3表達情況

a：P<0.05；b：P<0.01

圖1 CXCL10、CXCR3在治療前、后的白癜風(fēng)患者及健康對照外周血中的表達

a：P<0.05；b：P<0.01

圖2 CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞在治療前后的白癜風(fēng)患者及健康對照外周血中的比例

2.3不良反應(yīng)及安全性評價 無明顯不良反應(yīng)，治療前后肝腎功、三大常規(guī)檢測結(jié)果均正常。

3 討 論

中醫(yī)治療白癜風(fēng)已有幾千年歷史，療效肯定，但辨證分型較為復(fù)雜。筆者根據(jù)文獻總結(jié)及歷代醫(yī)家治療經(jīng)驗，認為白癜風(fēng)常虛實夾雜為患，白癜風(fēng)患者素體肝腎虧虛，風(fēng)邪挾瘀阻絡(luò)而致病。進展期白癜風(fēng)皮損逐漸擴大、增多，可伴癢感，這些臨床癥狀與風(fēng)邪善行而數(shù)變的致病特點吻合，因此進展期白癜風(fēng)“風(fēng)邪挾瘀”是其主要病理機制，以祛風(fēng)散邪為主要治法，兼以養(yǎng)血活血、滋補肝腎。本課題組前期已開展了白癜風(fēng)中藥復(fù)方對豚鼠白癜風(fēng)模型的治療作用研究，實驗觀察到中藥復(fù)方對豚鼠白癜風(fēng)模型有較好的復(fù)色作用，能夠促進黑色素的增多，說明本方對白癜風(fēng)治療有效，但其內(nèi)在作用機制目前尚不清楚[5]?，F(xiàn)代中藥藥理研究認為黃芪、白術(shù)、防風(fēng)具有良好的免疫調(diào)節(jié)功能，補益藥物女貞子、旱蓮草對酪氨酸酶具有較強的激活作用[6]。光敏藥物補骨脂、白芷能增強皮膚對紫外光的敏感性，從而加速黑素的生物合成。CXCL10、CXCR3及T細胞亞群均是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，本研究所用的中藥成分大部分具有調(diào)節(jié)免疫的功能，實驗結(jié)果也證實了本實驗所用的復(fù)方中藥有調(diào)節(jié)免疫的作用。同時治療前后所有患者肝腎功、三大常規(guī)結(jié)果均正常，說明本研究所用復(fù)方中藥具有較好的安全性。

CXCL10是CXC亞家族趨化因子，最新的研究顯示在CXC亞類趨化因子家中，CXCL10與白癜風(fēng)關(guān)系最為密切。RASHIGHI等[7]研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損和血清中CXCL10升高，并且通過白癜風(fēng)小鼠模型說明CXCL10在白癜風(fēng)疾病進展和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。WANG等[8]發(fā)現(xiàn)非節(jié)段型進展期白癜風(fēng)患者血清中CXCL10明顯升高，外周血單個核細胞中CXCR3 mRNA也明顯升高，而白癜風(fēng)的發(fā)病最終階段是細胞毒性T細胞(cytotoxic lymphocyte,CTL)遷移至皮膚，殺傷表皮中的黑素細胞，由此說明CXCL10/CXCR3信號軸可能參與將CD8+T細胞募集至皮膚的過程，并認為血清CXCL10可能是一個新的監(jiān)測疾病活動的生物標(biāo)記，對白癜風(fēng)的治療有一定的指導(dǎo)意義。目前少有CXCL10/CXCR3信號軸與白癜風(fēng)相關(guān)性的研究，本實驗進行此研究的同時還探討了復(fù)方中藥對這一機制的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，白癜風(fēng)患者治療前血清中CXCL10及CXCR3水平均明顯高于健康對照組，與既往研究結(jié)果一致。在使用復(fù)方中藥治療1個月后 CXCL10水平明顯下降，提示本研究使用的復(fù)方中藥能通過調(diào)控CXCL10，進而阻斷CXCL10/CXCR3信號軸，促進白癜風(fēng)患者皮損的穩(wěn)定及好轉(zhuǎn)。至于CXCR3的表達水平無明顯變化，可能由于CXCR3主要表達在Th1細胞表面，在血清中的分泌表達較少。

CD4+、CD8+T細胞為T細胞兩個主要的亞群，CD4+T細胞活化后主要分化為Th細胞,CD8+T細胞活化后主要分化為CTL。Th細胞能分泌多種細胞因子，對機體的特異性免疫及非特異性免疫均有重要的調(diào)節(jié)作用。CTL可高表達皮膚淋巴細胞相關(guān)抗原(CLA)，招募T細胞向皮膚歸巢，導(dǎo)致CTL到達皮膚后直接參與黑素細胞特異性的殺傷過程。DWIVEDI等[4]研究顯示白癜風(fēng)患者外周血中CD4+/CD8+細胞比值明顯低于健康對照組，說明白癜風(fēng)的發(fā)病可能與免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡有關(guān)。ANTELO等[9]研究顯示白癜風(fēng)患者外周血中CD8+T細胞明顯下降，可能與患者皮損及皮損周圍中CD8+T細胞增加有關(guān)。SANDOVAL-CRUZ等[10]研究也發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損邊緣處皮膚活檢T細胞比率明顯高于非皮損處，且大部分為CD8+T細胞。本研究結(jié)果顯示白癜風(fēng)患者外周血中CD4+、CD8+T細胞在數(shù)量上低于健康對照組，與既往研究結(jié)果一致，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能與樣本量太少有關(guān)，適當(dāng)增加樣本量之后可能會有顯著差異。治療后患者外周血中CD4+、CD8+T細胞數(shù)量較治療前顯著增多，并更加接近健康對照組水平，說明本實驗所用復(fù)方中藥對CD4+、CD8+T細胞具有一定的調(diào)節(jié)作用。

綜上所訴，CXCL10及CXCR3的高表達可以促進白癜風(fēng)皮損的發(fā)生和進展，外周血CD4+T細胞比例降低、皮損中CD8+T細胞比例升高也與白癜風(fēng)的發(fā)病有關(guān)。服用復(fù)方中藥治療1個月后，CXCL10及CXCR3的表達水平顯著下降，外周血中CD4+、CD8+T細胞的細胞比例升高，由此推測本研究所用復(fù)方中藥可能主要是通過調(diào)節(jié)機體細胞免疫功能發(fā)揮作用。

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