維生素D聯(lián)合葛根素對四氯化碳致大鼠肝纖維化的作用及機制*

韋斯軍，黃干榮，曾海生，周歧驥，莫昕瑩,徐靈源，廖作莊

(1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥劑科，廣西百色 533000；2.右江民族醫(yī)學院桂西地區(qū)微生物感染研究重點實驗室培育基地，廣西百色 533000)

肝纖維化是各種慢性肝臟疾病的病理結(jié)構(gòu)改變，其實質(zhì)是在各種致病因素的作用下，肝臟星狀細胞合成的細胞外基質(zhì)明顯增加，超出了肝臟自身的降解能力[1-2]。四氯化碳(CCl4)是一種十分經(jīng)典的肝纖維化造模毒物，大量應用于基礎研究[3]。有研究從體內(nèi)證實維生素D能降低肝臟纖維化，從體外實驗證實維生素D能減少肝臟星狀細胞膠原纖維的分泌[4]。也有文獻報道葛根素能改善肝纖維化，其可能與下調(diào)TNF-α信號通路降低肝星狀細胞活化有關(guān)[5-6]?？梢?，維生素D與葛根素單獨使用具有抑制纖維化的效果，其作用機制有一定的交叉重疊，均與抑制肝星狀細胞的活化及其膠原纖維的分泌有關(guān)。但二者聯(lián)合是否能增強抗肝纖維化的作用未有報道，因此本研究用CCl4肝纖維化大鼠模型，探討維生素D聯(lián)合葛根素對肝纖維化的作用效果及其機制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級健康雄性Wistar大鼠50只，周齡相近，體質(zhì)量200 g左右，由右江民族醫(yī)學院動物中心提供。CCl4為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。維生素D與葛根素購于Sigma公司，玉米油購于和光純藥工業(yè)株式會社，天狼星紅染色液購于北京雷根生物技術(shù)有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒購于瑞士Roche公司，核因子-κB(NF-κB)和腫瘤壞死因子(TNF-α)抗體購于美國Santa cruze公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.2方法 將Wistar大鼠50只分為5組。CCl4組，按照3 mL/kg的比例腹腔注射45% CCl4玉米油溶液，每周2次；正常對照組(C組)，給予等量的生理鹽水，腹腔注射，每周2次；維生素D組(V組)、葛根素組(P組)及維生素D聯(lián)合葛根素組(V+P組)為相應藥物干預組，在CCl4玉米油溶液造?；A上分別按照維生素D 2.0 μg/kg、葛根素0.4 g/kg、維生素D 2.0 μg/kg與葛根素0.4 g/kg的比例灌胃，每周2次。每次灌喂之前禁食1 h，C組在實驗中灌胃等量生理鹽水。共8周，在實驗結(jié)束的前1晚禁食過夜。第2天處死大鼠，取全血，室溫靜置20 min，以5 000 r/min離心15 min，取上清液，得到血清，用試劑盒檢測血中透明質(zhì)酸(HA)。取大鼠肝臟，用試劑盒檢測肝臟中的羥脯氨酸(Hyp)。一部分肝臟用多聚甲醛溶液固定，常規(guī)制備石蠟切片，進行天狼星紅染色，顯微鏡下觀察肝臟組織切片的病理變化及纖維化的嚴重程度。通過實時熒光定量PCR檢測膠原蛋白(Collagen) Ⅰ、Ⅲ mRNA及Western blot檢測NF-KB和TNF-α蛋白水平。

表1 引物名稱及序列

F:正向引物;R:反向引物

2 結(jié) 果

2.1血和肝生化指標的測定結(jié)果 HA是分布于肝細胞周圍的一種蛋白多糖，肝纖維化時血中水平明顯增加[7]。肝臟中的Hyp是肝臟膠原纖維的重要組成部分，纖維化發(fā)生時肝臟中水平也明顯增加[8]。因此這兩者是肝纖維的重要診斷指標。CCl4組的HA和Hyp均明顯高于C組，一定程度上表明肝纖維化模型建立成功。V組、P組及V+P組的HA和Hyp水平相對于CCl4組明顯降低，而且V+P組降低得最為明顯，見表2。

表2 血液與肝臟生化指標

a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

2.2肝臟組織病理切片觀察結(jié)果 大鼠肝組織纖維化面積CCl4組最大，C組最小(P<0.05)，各給藥組中V+P組纖維化面積最小，見圖1。

A:C組；B:CCl4組；C:V組；D：P組；E:V+P組；F:天狼星紅染色陽性面積統(tǒng)計圖；a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

圖1 天狼星紅染色切片(×200)

續(xù)表3 肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平

a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

2.3肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平 大鼠肝臟Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平，CCl4組最高，C組最低(P<0.05)，各給藥組中V+P組Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA水平最低，見表3。

2.4肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平 大鼠肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平，CCl4組最高，C組最低(P<0.05)，各給藥組中V+P組NF-κB蛋白水平最低，P組與V+P組TNF-α比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

A:Western blot檢測肝臟TNF-α與NF-NF-κB蛋白水平；B:TNF-α灰度分析；C:NF-κB灰度分析。a:P<0.05，與C組比較；b:P<0.05，與CCl4組比較組；c：P<0.05，與V組比較；d：P<0.05，與P組比較；e：P<0.05，與V+P組比較

圖2肝臟TNF-α與NF-κB蛋白水平比較

3 討 論

肝纖維化是慢性肝疾病在進程中不可避免的病理改變，若不阻斷其進程，進一步發(fā)展就會演變?yōu)楦斡不８卫w維化的致病因素十分多樣，如病毒、寄生蟲、酒精及其他一些毒物包括CCl4。其實質(zhì)可以歸納為肝實質(zhì)細胞外的細胞外基質(zhì)的生成與降解的平衡紊亂，這些細胞外基質(zhì)在肝臟內(nèi)不斷積聚，其中最主要的成分就是膠原纖維[9]。而肝星狀細胞是細胞外基質(zhì)生成與降解的主要參與者，因此其活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。

維生素D大部分通過肝臟合成，而且肝臟本身也是其作用的靶器官之一。文獻報道維生素D可以改善CCl4導致的大鼠纖維化，而且離體實驗表明可能與其降低肝星狀細胞活化與膠原纖維分泌減少有關(guān)。葛根素作為一種被大量應用于臨床的黃酮類藥物，有研究表明其也能降低CCl4導致的肝纖維化，其中NF-κB/TNF-α信號通路是被抑制的，但葛根素與維生素D聯(lián)用后該信號通路是否也被明顯抑制未見報道。由于大量文獻報道氧化應激與肝纖維化密切相關(guān)，且NF-κB/TNF-α信號通路在肝星狀細胞活化中起著十分重要的作用[10]，所以，無論是單用維生素D還是葛根素，在肝纖維化過程中保護肝臟都與抑制肝星狀細胞的功能密切相關(guān)，這提示二者聯(lián)用可能會發(fā)揮更大保護作用。

維生素D和葛根素均能明顯降低大鼠HA及肝臟中的Hyp水平，使得大鼠肝臟膠原纖維明顯降低。維生素D聯(lián)合葛根素對各種損傷指標的降低及膠原纖維沉積的改善最為明顯，從而證實了二者有協(xié)同作用，聯(lián)用對肝纖維化的保護作用更明顯。

肝臟纖維化的實質(zhì)是肝臟細胞外基質(zhì)的生成增加而降解減少。細胞外基質(zhì)的主要成分是膠原纖維，而 Collagen Ⅰ、Ⅲ是膠原纖維的主要存在形式，大部分是由肝星狀細胞合成[11]。在肝纖維化的進程中，NF-κB和TNF-α是重要的信號分子。TNF-α介導下游NF-κB的激活，而NF-κB在肝星狀細胞的活化過程中發(fā)揮極其重要的作用[12]。維生素D和葛根素均能降低這些分子的mRNA及蛋白水平，維生素D聯(lián)合葛根素的降低作用同樣最為明顯。以上研究提示維生素D聯(lián)合葛根素在肝纖維化過程的保護作用是降低肝星狀細胞的活化及其膠原纖維的分泌。

本項研究探討了維生素D聯(lián)合葛根素對CCl4誘導的大鼠纖維化的保護作用，其聯(lián)合用藥比單獨用藥抗肝纖維化效果更好，并初步探究了其機制與Collagen Ⅰ、Ⅲ mRNA及NF-κB和TNF-α的蛋白水平增加有關(guān)，這對臨床實踐有一定的參考價值。但調(diào)控途徑往往由多因子、多路徑參與，其作用機制還有待進一步探究。

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