外源性NPM突變蛋白對(duì)AKT細(xì)胞定位的影響及其對(duì)白血病增殖的意義*

全 靜，王 春，李寶林，劉靳波

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000；2.四川省瀘州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科 646000)

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)主要定位于細(xì)胞的核仁顆粒區(qū)，屬核質(zhì)穿梭蛋白，它廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，結(jié)構(gòu)高度保守，是一種重要的伴侶分子[1]。A型突變(NPM mutant A,NPM mA)是NPM最為常見的突變類型，占75%～80%[2]。白血病是一組造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病，在治療上具有明顯的異質(zhì)性，NPM突變?cè)谂R床上與白血病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。研究表明，突變后的NPM蛋白可攜帶抑癌蛋白p19ARF[4]、NF-kappa B[5]、c-myc[6]等核內(nèi)蛋白發(fā)生胞質(zhì)移位，通過(guò)影響其穩(wěn)定性從而促進(jìn)白血病細(xì)胞的惡性增殖。白血病發(fā)生、發(fā)展中存在蛋白激酶B(protein kinase B,AKT) 信號(hào)通路的過(guò)度激活，與白血病細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)化和黏附等生物學(xué)功能密切相關(guān)[7]。本研究旨在探討外源性NPM mA與AKT的相互關(guān)系，以及NPM mA對(duì)AKT的亞細(xì)胞定位的影響，并進(jìn)一步觀察NPM mA與AKT對(duì)白血病細(xì)胞增殖的意義，從而深入認(rèn)識(shí)NPM突變蛋白在白血病發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1質(zhì)粒與細(xì)胞 MSCV-IRES-GFP、MSCV-Flag-NPM wt和MSCV-Flag-NPM mA質(zhì)粒由美國(guó)圣猶大兒童研究醫(yī)院惠贈(zèng)，HA-AKT、pEnvelope 和 pHelp質(zhì)粒由美國(guó)安德森癌癥研究中心惠贈(zèng)，人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562和人胚腎HEK293T細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2藥品與試劑 胎牛血清(FBS,上海普飛生物技術(shù)有限公司)；RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基(Gibco-BRL公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；兔抗人NPM mA單克隆抗體(Abcam公司)；小鼠抗人NPM單克隆抗體、Protein A/G beads(Santa Cruz公司)；小鼠抗Flag標(biāo)簽抗體、小鼠抗HA標(biāo)簽抗體、兔抗人AKT單克隆抗體(Cell Signal Technology公司)；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG、Alexa Fluor?594山羊抗鼠IgG、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋公司)；苯甲基磺酰氟(PMSF)蛋白酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)；AKT抑制劑(AKT inhibitor Ⅳ，AKT Ⅳ；Calbiochem公司)；CCK8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，K562細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 已知NPM1基因是雜合性突變，人K562和HEK293T細(xì)胞株均存在野生型NPM蛋白，不存在NPM mA。本研究中K562細(xì)胞設(shè)立空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組(K562 c1)、野生組(K562 wt)和突變組(K562 mA)。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將空載體MSCV-IRES-GFP(vector)和實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒MSCV-Flag-NPM wt(Flag-NPM wt)、MSCV-Flag-NPM mA(Flag-NPM mA)連同 pEnvelope及pHelper輔助載體分別共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞。培養(yǎng)6 h后更換含有10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基，于24、48 h收集上清液，經(jīng)0.45 μm 濾器過(guò)濾收獲病毒液。將K562細(xì)胞接種于6孔板，加入制備好的病毒液，同時(shí)加入終濃度為8 mg/mL 的聚凝胺，擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3Western blot 收集細(xì)胞，用含100 mmol/L PMSF的細(xì)胞裂解液[10 mmol/L Tris鹽酸(pH 7.4),5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),150 mmol/L NaCl，1%曲拉通X-100(Triton X-100),250 mmol/L原釩酸鹽,20 mmol/L b-甘油磷酸]充分裂解提取細(xì)胞總蛋白。取60 μg蛋白用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉常溫封閉2 h后加一抗(1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸吐溫緩沖液(TBST) 洗滌10 min×2次，Tris鹽酸緩沖液(TBS)洗滌10 min，加二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h ，洗滌后用化學(xué)發(fā)光顯色試劑進(jìn)行顯色。實(shí)驗(yàn)設(shè)β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參，結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行分析。

1.3.4免疫共沉淀(Co-IP) 收集細(xì)胞，提取總蛋白，將細(xì)胞裂解液用E1A試劑[0.1% NP-40，50 mmol/L HEPES(pH 7.5),250 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA]定至1 mL體積，加入1 μg抗AKT的單克隆抗體，4 ℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育過(guò)夜。次日加入50 μL Ptotein A/G 磁珠(beads)，4 ℃緩慢旋轉(zhuǎn)孵育4 h，3 000 r/min離心2 min，將beads離心至管底后棄上清。用E1A試劑反復(fù)清洗beads，3 000 r/min離心2 min去除上清液，再用30 μL 2倍濃度的上樣緩沖液重懸，95 ℃煮沸5 min使蛋白復(fù)合物變性，13 000 r/min離心2 min取上清進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.5免疫熒光 取轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞制備成1×106的單細(xì)胞懸液，取100 μL 接種于12孔板中的滅菌蓋玻片上，于5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，用PBS輕輕洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次。0.1% Triton X-100透膜10 min，用10%山羊血清室溫封閉30 min，加封閉液稀釋的單克隆一抗(1∶100) 置4 ℃冰箱過(guò)夜。PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記的二抗(1∶200)，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次后4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染色5 min，最后用甘油封片。熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)的分布情況。

1.3.6CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集轉(zhuǎn)染后的各組K562細(xì)胞，分別用低劑量AKT Ⅳ或者等劑量二甲基亞砜(DMSO)處理白血病細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育，培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72 h每孔加入10 μL CCK-8(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在A450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的光密度(OD)值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)用SigmaPlot12.0軟件繪制生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié) 果

2.1K562細(xì)胞中NPM mA與AKT的相互關(guān)系 分別轉(zhuǎn)染vector、Flag-NPM wt、Flag-NPM mA于K562細(xì)胞中,采用Co-IP檢測(cè)NPM mA與AKT的結(jié)合作用。用抗AKT的單克隆抗體沉淀蛋白復(fù)合物后電泳轉(zhuǎn)膜，用Flag抗體進(jìn)行免疫印跡分析。Western blot結(jié)果表明，K562 mA組在相對(duì)分子量32×103附近檢測(cè)到NPM mA蛋白，見圖1。上述結(jié)果提示K562細(xì)胞中NPM mA蛋白能與AKT結(jié)合。

Western blot檢測(cè)Co-IP蛋白復(fù)合物中的flag-NPM mA蛋白，WCE:全細(xì)胞裂解液

圖1外源性NPM、NPM mA與AKT的相互作用

2.2外源性NPM mA對(duì)AKT亞細(xì)胞定位的影響 在HEK293T細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染HA-AKT和Flag-NPM mA，熒光染色后觀察目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的分布情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染HA-AKT的293T細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞漿可見很強(qiáng)的HA-AKT特異性熒光，轉(zhuǎn)染Flag-NPM mA的293T細(xì)胞在細(xì)胞核和細(xì)胞漿均可見熒光信號(hào)，而熒光信號(hào)主要集中于細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)域，見圖2A。此外，共同轉(zhuǎn)染Flag-NPM mA和HA-AKT到HEK293T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)帶紅色熒光的NPM mA主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)域，而帶綠色熒光的AKT蛋白也在細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)域累積，提示移位到胞質(zhì)的NPM突變蛋白可能與AKT蛋白共同定位于胞質(zhì)中，見圖2B。

A：HEK293T細(xì)胞中Flag-NPM mA和HA-AKT蛋白的亞細(xì)胞定位；B：共同轉(zhuǎn)染后Flag-NPM mA和AKT蛋白的亞細(xì)胞定位；HA-AKT、Flag-NPM mA呈紅色熒光，AKT呈綠色熒光，細(xì)胞核DAPI染色呈藍(lán)色熒光，MERGE為融合圖像

圖2外源性NPM mA與AKT的亞細(xì)胞定位(×400)

A： CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組K562細(xì)胞的體外增殖能力，Western blot圖為轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞中NPM和NPM mA的表達(dá)情況；a：P<0.01，與K562 c1組和K562 wt組比較；B：CCK-8法檢測(cè)AKT Ⅳ處理后各組K562細(xì)胞的體外增殖能力；b：P<0.01，與K562 c1+AKT Ⅳ組和K562 wt+AKT Ⅳ組比較

圖3過(guò)表達(dá)NPM mA聯(lián)合AKT Ⅳ對(duì)K562細(xì)胞體外增殖的影響

2.3外源性NPM mA與AKT對(duì)白血病細(xì)胞增殖的意義 圖3A中結(jié)果顯示，K562 mA組和K562 wt組與 K562 c1組相比NPM表達(dá)量上升，僅K562 mA組表達(dá)NPM mA。CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞不同時(shí)間的生長(zhǎng)曲線變化情況。結(jié)果顯示，72 h后K562 mA組相對(duì)于K562 c1組和K562 mA組細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，見圖3A。觀察AKT Ⅳ處理后各組細(xì)胞的體外增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，48 h后K562 wt組和K562 c1組體外增殖能力明顯被抑制，K562 mA組細(xì)胞仍能維持生長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義意義(P<0.01)，見圖3B。

3 討 論

NPM基因突變對(duì)白血病細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化具有重要調(diào)控作用[8]。NAKAGAWA等[9]提出，NPM C末端色氨酸對(duì)NPM的核仁定位起主要作用，突變的NPM C末端存在額外的NES核輸出序列，可導(dǎo)致NPM移位到細(xì)胞胞質(zhì)。NPM突變并胞質(zhì)移位后，ARF/p53的穩(wěn)定性降低，癌蛋白c-myc活性增強(qiáng)從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖[10-11]。目前的機(jī)制研究多集中于NPM突變后對(duì)核仁蛋白活性的改變，聚積在胞質(zhì)中的NPM對(duì)胞質(zhì)蛋白的影響少有報(bào)道。AKT是調(diào)節(jié)造血的中央樞紐，可以通過(guò)多種途徑影響白血病細(xì)胞的增殖與凋亡。既往研究發(fā)現(xiàn)，OCI/AML3細(xì)胞中天然攜帶的NPM mA能夠與AKT相互結(jié)合，并可能參與調(diào)控細(xì)胞的增殖[12]。本研究進(jìn)一步探討外源性的NPM mA與AKT的相互作用，觀察外源性NPM mA對(duì)AKT的亞細(xì)胞定位的影響，進(jìn)一步檢測(cè)外源性NPM mA與AKT對(duì)白血病細(xì)胞增殖的意義。

采用Co-IP檢測(cè)NPM mA與AKT的結(jié)合作用，結(jié)果顯示，K562 mA組在相對(duì)分子質(zhì)量32×103附近檢測(cè)到了NPM mA的蛋白條帶，說(shuō)明NPM mA能與AKT結(jié)合。FALINI等[13]將突變的NPM轉(zhuǎn)染到NIH3T3細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，突變的NPM蛋白主要聚集在胞質(zhì)中。本研究熒光染色結(jié)果顯示，NPM mA主要集中分布于胞質(zhì)，此結(jié)果與FALINI等[13]研究一致。而AKT彌散分布于細(xì)胞中，當(dāng)共同轉(zhuǎn)染NPM mA和AKT到HEK293T細(xì)胞后，AKT的定位發(fā)生改變，由彌散分布轉(zhuǎn)移至細(xì)胞胞質(zhì)。此結(jié)果說(shuō)明，NPM發(fā)生突變后，突變的NPM蛋白可能攜帶AKT發(fā)生了轉(zhuǎn)移并最終改變了AKT的亞細(xì)胞定位。

為了觀察外源性NPM mA與AKT對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響，本研究選擇不攜帶NPM 突變基因的K562 細(xì)胞作為研究載體，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染使K562細(xì)胞表達(dá) NPM mA 蛋白。CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后K562細(xì)胞的體外增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K562 mA組細(xì)胞相對(duì)于K562 c1組和K562 wt組細(xì)胞體外增殖能力明顯增強(qiáng)，此結(jié)果在本課題組以往的研究中亦有闡述[14]。AKT Ⅳ可抑制AKT的磷酸化激活。本研究中，采用低劑量AKT Ⅳ處理48 h后，K562 wt組和K562 c1組體外增殖能力被明顯抑制，K562 mA組細(xì)胞仍能維持生長(zhǎng)，提示NPM mA能通過(guò)AKT調(diào)控K562細(xì)胞的體外惡性增殖。

綜上所述，本研究證實(shí)外源性的NPM mA能夠與AKT結(jié)合并改變AKT的亞細(xì)胞定位，且NPM mA能通過(guò)AKT調(diào)控K562細(xì)胞的體外惡性增殖。進(jìn)一步研究將繼續(xù)探討胞質(zhì)NPM mA對(duì)AKT活性的調(diào)控方式及對(duì)AKT下游信號(hào)分子的影響，而NPM mA對(duì)胞質(zhì)中其他蛋白活性的影響亦是值得研究的方向。深入探討NPM突變蛋白在白血病發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制，將為闡明白血病的致病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

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