趨化因子受體CXCR4及其配體CXCL12在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制

張引，余力信，張發(fā)鵬，余曉雯，王文龍，羅志強(qiáng)

原發(fā)性肝細(xì)胞性肝癌（Primary hepatocellular carcinoma，PHC）是全球范圍內(nèi)極具危害性的惡性腫瘤之一，我國每年至少30萬人死于PHC，占全世界肝癌死亡人數(shù)的半數(shù)以上［1-2］。而肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肝癌患者死亡的主要原因［3］。趨化因子（chemokine）是細(xì)胞因子超家族成員中具有化學(xué)趨化作用的小分子蛋白質(zhì)［4］。CXC趨化因子配體12（CXCL12），又稱基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 1（SDF-1），是由骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其他相關(guān)的間皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌的一種趨化蛋白，包括α和β兩種異構(gòu)體，屬于趨化因子CXC亞家族［5］。CXCR4則是高度保守的7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR），由 352個(gè)氨基酸組成，其編碼基因位于染色體2q21，其胞外N端區(qū)與配體結(jié)合，胞內(nèi)區(qū)則與G蛋白偶聯(lián)，C端含絲氨酸/蘇氨酸可磷酸化，主要參與信號(hào)傳導(dǎo)［6］。CXCL12能與CXCR4特異性結(jié)合，與CXCR4相互作用后啟動(dòng)下游信號(hào)通路，形成CXCL12/CXCR4生物軸而發(fā)揮作用，并在介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)、維持胚胎發(fā)育、調(diào)控造血、誘導(dǎo)血管生成、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［7-8］。新近的研究報(bào)道CXCL12/CXCR4與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)［9-10］，然而其具體機(jī)制仍不清楚。本研究通過觀察CXCL12/CXCR4在肝癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，旨在探討其抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病例標(biāo)本 收集2013年1月—2015年6月我科手術(shù)切除的60例肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為肝細(xì)胞癌。所有患者術(shù)前均未接受放化療，其中男32例，女28例，平均年齡（63.0±2.5）歲，標(biāo)本收集后立即置于液氮保存。以上標(biāo)本采集均由患者本人知情同意并通過南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核同意。

1.2 細(xì)胞及試劑 正常肝細(xì)胞7702和4種肝癌細(xì)胞Huh7、HepG2、MHCC97h、Hep3B購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，DMEM、MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自TAKARA生物工程有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購于美國Corning公司；CXCR4干擾質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的空載體對(duì)照質(zhì)粒均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。CXCL12、CXCR4、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）抗大鼠單克隆抗體購自美國Abcam公司；BALB/C裸鼠（SPF級(jí)，雄性，6只，體質(zhì)量18～20 g）購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 Western blot法檢測(cè)肝癌及癌旁組織中CXCL12、CXCR4的表達(dá) 將收集的肝癌組織和癌旁組織用RIPA裂解液（含PMSF）裂解后提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。制備的蛋白樣本經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后按照凝膠面積以0.65 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移1.5 h將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。含5%牛血清白蛋白的封閉液室溫封閉1 h，加入1∶500稀釋的一抗（CXCL12、CXCR4、Tubulin），4℃反應(yīng)過夜；次日 TBST漂洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗（1∶10 000），室溫下反應(yīng) l h；TBST漂洗 3次，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影成像，ECL發(fā)光系統(tǒng)曝光檢測(cè)。采用Image J分析所得圖像，CXCL12/Tubulin和CXCR4/Tubulin灰度比值分別表示CXCL12和CXCR4蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 免疫組化檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中CXCL12、CXCR4的表達(dá) 采用免疫組化EnVision兩步法。將收集到的肝癌組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織按照3～4μm厚度組織切片，經(jīng)過脫蠟、梯度乙醇水化、PBS清洗、抗原修復(fù)后，分別滴加CXCL12、CXCR4抗體孵育，然后滴加增強(qiáng)復(fù)合物和二抗，37℃孵育30 min，PBS清洗后，DAB試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明30 min，中性樹膠和蓋玻片封片。用奧林巴斯顯微鏡采集圖像，以PBS作為陰性對(duì)照，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，已知陽性片作為陽性對(duì)照，根據(jù)染色程度判定CXCL12、CXCR4蛋白的表達(dá)情況。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè)肝癌組織和癌旁組織中CXCL12、CXCR4 mRNA的表達(dá) Trizol法分別提取肝癌組織和癌旁組織中的RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s）。然后以cDNA為模板應(yīng)用SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RnaseH Plus）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95℃30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。CXCR4 引物：上游 5′-cgaggaaatgggctcaggg-3′，下游 5′-gttggtggcgtggacgatg-3′。CXCL12 引物：上游 5′-cgattcttcgaaagccatta-3′，下游 5′-cttggtggctctccacccta-3′。內(nèi)參 GAPDH引物：上游 5′-aggtcggagtcaacggatttggtcg-3′，下游 5′-tggccaggggtgctaagcagt-3′。使用 2–ΔΔCt法分析肝癌組織和癌旁組織中 CXCL12、CXCR4 mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)及肝癌細(xì)胞株中CXCL12、CXCR4的mRNA表達(dá)檢測(cè) Huh7、MHCC97h、HepG2和Hep3B 4種肝癌細(xì)胞置于溫度37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。正常肝細(xì)胞7702用高糖型的DMEM和10%～20%胎牛血清培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，Trizol法提取RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，Real-time PCR法檢測(cè)5種細(xì)胞中CXCL12、CXCR4的mRNA表達(dá)水平。具體步驟和統(tǒng)計(jì)分析方法同1.3.3，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的構(gòu)建 將MHCC97h細(xì)胞接種于6 cm2培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度生長(zhǎng)至70%時(shí)換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明分別將20μg空載體質(zhì)粒（sh-control）和20μg CXCR4干擾質(zhì)粒（sh-CXCR4）轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，靜置6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，用遺傳霉素（G418）篩選陽性克隆；挑選陽性的單克隆細(xì)胞簇，在低劑量G418的條件下將單克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)采用Western blot法對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞記為sh-control，轉(zhuǎn)染sh-CXCR4質(zhì)粒的細(xì)胞記為sh-CXCR4。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sh-control和sh-CXCR4 MHCC97h細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化并計(jì)數(shù)后，取約1×105個(gè)細(xì)胞加入Transwell小室，用不含血清的培養(yǎng)液在5%CO2、37℃封閉環(huán)境下孵育36 h，4%甲醛固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗3～5遍。顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.7 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力 制備sh-control和sh-CXCR4 MHCC97h細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后種植約1×105個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后細(xì)胞均勻呈單層鋪滿于每孔中，用相同大小槍頭進(jìn)行劃痕，每孔劃痕粗細(xì)均勻，PBS清洗劃下的細(xì)胞，加入不含血清的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下于劃痕后0 h和24 h拍照，測(cè)量劃痕的寬度，計(jì)算細(xì)胞愈合率，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%，愈合率越高表示細(xì)胞的遷移能力越強(qiáng)。

1.3.8 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)sh-CXCR4表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sh-control和sh-CXCR4 MHCC97h細(xì)胞，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔約1 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每組細(xì)胞設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，每孔體積200μL。2組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6 d，每日取適量細(xì)胞，每孔加10μL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h；終止培養(yǎng)，每孔加100μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀記錄2組細(xì)胞490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3.9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sh-control和sh-CXCR4 MHCC97h細(xì)胞，隨機(jī)接種至6只裸鼠皮下，接種量為1×106個(gè)細(xì)胞/只，一般盡量在30 min內(nèi)完成。種植部位選擇血供豐富的腹股溝中上部，左側(cè)接種sh-CXCR4細(xì)胞，右側(cè)接種sh-control細(xì)胞。接種前用槍將細(xì)胞懸液充分吹散，防止細(xì)胞成團(tuán)而降低細(xì)胞成活率。在接種后的5、10、20、30、40 d測(cè)量瘤體的長(zhǎng)度和寬度，計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為：V（mm3）=（長(zhǎng)度×寬度2）/2。

1.3.10 Western blot檢測(cè)VEGF-C的表達(dá) 將sh-control和sh-CXCR4 MHCC97h細(xì)胞以及裸鼠移植瘤的瘤體用含PMSF的RIPA裂解液裂解后提取細(xì)胞總蛋白。常規(guī)SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、曝光、顯影后分析CXCR4和VEGF-C蛋白相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。同時(shí)參照1.3.5中的方法將CXCR4過表達(dá)質(zhì)粒GV-141-CXCR4和相應(yīng)空載體對(duì)照GV-141-Control分別轉(zhuǎn)染至MHCC97h細(xì)胞中。培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)2組細(xì)胞中VEGF-C的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析，2組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織和癌旁組織中CXCL12/CXCR4的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示，肝癌組織中CXCL12和CXCR4的表達(dá)水平均高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1。免疫組化結(jié)果亦顯示肝癌組織中CXCL12/CXCR4表達(dá)水平高于癌旁組織，見圖2。Real-time PCR顯示肝癌組織中CXCL12 mRNA和CXCR4 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，見圖3。

Fig.1 The expression levels of CXCL12/CXCR4 protein in liver cancer tissue and paracancerous tissue圖1 肝癌組織和癌旁組織中CXCL12/CXCR4蛋白表達(dá)情況

2.2 Huh7、MHCC97h、HepG2和 Hep3B 肝癌細(xì)胞中CXCL12/CXCR4表達(dá)情況 結(jié)果顯示，4種肝癌細(xì)胞中CXCL12 mRNA、CXCR4 mRNA的表達(dá)水平均高于正常肝細(xì)胞7702，見圖4。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取MHCC97h作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。

Fig.2 Immunohistochemical detection of CXCL12/CXCR4 expressions in liver cancer tissues and para-carcinoma tissues圖2 免疫組化檢測(cè)肝癌和癌旁組織CXCL12/CXCR4蛋白表達(dá)

Fig.3 Real-time fluorescence quantitative detection of expressions of CXCL12/CXCR4 in liver cancer tissue and para-carcinoma tissue圖3 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)肝癌及癌旁組織CXCL12/CXCR4表達(dá)情況

2.3 轉(zhuǎn)染sh-CXCR4對(duì)MHCC97h細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-CXCR4組的穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于sh-control組［（16.2±4.3）個(gè)vs.（26.4±5.4）個(gè)，t=5.358，P＜0.05］，sh-CXCR4組細(xì)胞的侵襲能力較sh-control組明顯降低，見圖5。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-CXCR4組細(xì)胞在劃痕24 h后的愈合率明顯低于sh-control組［（54.5±8.3）%vs.（83.3±4.8）%，t=4.653，P＜0.05］，見圖 6。同時(shí) MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染 sh-CXCR4后MHCC97h細(xì)胞的生長(zhǎng)能力較sh-control組明顯降低，見圖7。

Fig.4 CXCL12 and CXCR4 mRNA expressions in liver cancer cells Huh7,MHCC97h,HepG2 and Hep3B圖4CXCL12、CXCR4 mRNA在肝癌細(xì)胞Huh7、MHCC97h、HepG2和Hep3B中的表達(dá)情況

Fig.5 Comparison of the numbers of cell permeating septum between the two groups圖5 2組穿膜細(xì)胞數(shù)比較

Fig.6 Results of the wound scratch assay between the two groups圖6 2組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 sh-CXCR4對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sh-CXCR4和sh-control MHCC97h細(xì)胞株，接種至裸鼠皮下建立人肝癌裸鼠皮下瘤模型，觀察荷瘤裸鼠腫瘤內(nèi)CXCR4蛋白表達(dá)及腫瘤大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sh-CXCR4側(cè)小鼠瘤體體積明顯小于shcontrol側(cè)，見圖 8。

2.5 CXCR4的表達(dá)與VEGF-C的關(guān)系 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，sh-CXCR4組VEGF-C的表達(dá)較sh-control組明顯下降，見圖9A；相反，在MHCC97h細(xì)胞中過表達(dá) CXCR4后，MHCC97h細(xì)胞中的VEGF-C的表達(dá)明顯升高，見圖9B。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，接種轉(zhuǎn)染sh-CXCR4的MHCC97h細(xì)胞成瘤的瘤體中VEGF-C的表達(dá)明顯下降，見圖10。

Fig.7 Comparison of the cell proliferative ability between the two groups圖7 2組細(xì)胞增殖能力變化

Fig.8 The growth states of subcutaneous tumors of nude mice inoculated with sh-CXCR4 and sh-control圖8 接種sh-CXCR4和sh-control后裸鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)變化

Fig.9 The expression levels of VEGF-C protein after altering the expression of CXCR4圖9 改變CXCR4表達(dá)后MHCC97h細(xì)胞中VEGF-C蛋白表達(dá)變化

Fig.10 The expression of VEGF-C protein detected in sh-control and sh-CXCR4 groups of mice圖10 sh-control和sh-CXCR4組小鼠瘤體中VEGF-C蛋白的表達(dá)情況

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國乃至全世界常見、且極具危害性的惡性腫瘤之一。大量研究證實(shí)原發(fā)性肝癌預(yù)后不良的主要原因在于肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［11-12］。因此，研究原發(fā)性肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制有重要意義。趨化因子是細(xì)胞因子超家族中一大類具有化學(xué)趨化作用的小分子蛋白質(zhì)［13］。目前研究證實(shí)，趨化因子的異常表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Muller等［14］研究報(bào)道趨化因子和其對(duì)應(yīng)的受體與腫瘤轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。目前研究已經(jīng)證實(shí)至少有50多種趨化因子和20種趨化因子受體與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是其機(jī)制仍不清楚［15-16］。CXCL12屬于趨化因子CXCL亞家族中最重要的因子之一。研究證實(shí)在肝癌組織中CXCL12表達(dá)明顯高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織。過表達(dá)CXCL12可以增加肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，相反，降低CXCL12的表達(dá)可以顯著地抑制肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［17-18］。然而，CXCL12在肝癌中的作用機(jī)制仍不清楚。

CXCR4是高度保守7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體，是目前20種趨化因子受體中最重要的受體之一［19］。CXCL12可以與CXCR4結(jié)合啟動(dòng)下游信號(hào)通路形成CXCL12/CXCR4生物軸。研究報(bào)道人乳腺癌組織中趨化因子受體CXCR4表達(dá)明顯增加。高表達(dá)CXCR4的乳腺癌患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯高于低表達(dá)患者［20-22］。Scala 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤患者中出現(xiàn)高表達(dá)CXCR4的病情進(jìn)展更快。另外，CXCR4陽性的食管癌患者平均總的生存時(shí)間明顯短于CXCR4陰性的食管癌患者［24-25］。因此，CXCR4與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切的關(guān)系，CXCL12/CXCR4軸在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用，這可能和腫瘤的轉(zhuǎn)移過程密切有關(guān)［26-27］。在肝癌患者中，CXCL12/CXCR4軸與肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響有待進(jìn)一步的研究［28-29］。在本次實(shí)驗(yàn)中，筆者首先證實(shí)肝癌患者CXCL12/CXCR4存在高表達(dá)；進(jìn)而通過轉(zhuǎn)染CXCR4干擾質(zhì)粒至肝癌細(xì)胞MHCC97h，發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)下調(diào)后肝癌細(xì)胞侵襲、遷移和增殖能力明顯下降，這些結(jié)果證實(shí)CXCL12/CXCR4軸在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。

研究已經(jīng)證實(shí)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是促進(jìn)腫瘤血管新生和轉(zhuǎn)移的最重要細(xì)胞因子之一［30］。吳唯等［31］研究證實(shí)，在乳腺癌細(xì)胞中CXCL12可通過AKT信號(hào)通路上調(diào)VEGF表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，通過siRNA沉默技術(shù)下調(diào)CXCL12表達(dá)后，可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞株中VEGF的表達(dá)。本研究進(jìn)一步證實(shí)下調(diào)CXCR4的表達(dá)同樣可以通過抑制VEGFC的表達(dá)；相反，過表達(dá)CXCR4可以明顯促進(jìn)VEGF-C蛋白的表達(dá)。綜上，本研究證實(shí)CXCL12/CXCR4在肝癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)CXCR4可通過抑制VEGF-C蛋白的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

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