攜帶小鼠KLF4基因重組慢病毒的構(gòu)建及對RAW264.7細胞增殖的影響

楊紅艷 ，李鑫 ，向國安 ，王如剛 ，蔡衛(wèi)紅 ，羅虎 ，梁婧 ，姬文婕

Krüppel樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）作為一種重要的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在機體內(nèi)廣泛表達，參與調(diào)節(jié)細胞周期、分化、增殖和DNA合成，在不同的細胞背景下顯示出不同的功能［1］。KLF4的表達水平與一些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。早在2006年，Takahashi等［2］通過 KLF4、Oct4、Sox2 和 C-myc轉(zhuǎn)錄因子成功獲取了誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。KLF4 作為 4 個胚胎干細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子之一，具有重要的生物學潛能［3］。由此可見KLF4基因在機體內(nèi)發(fā)揮重要作用，本研究借助慢病毒載體使小鼠的KLF4基因在小鼠腹腔巨噬細胞RAW264.7細胞中過表達以建立RAW264.7細胞株，進而更加深入地觀察KLF4在機體內(nèi)的作用，為繼續(xù)探討KLF4在疾病中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pLVX-mCMV-PGK質(zhì)粒、感受態(tài)細胞DH5α、pSPAX2質(zhì)粒、pMD2.G質(zhì)粒、293T細胞為本實驗室保存；RAW264.7細胞由南開大學生命科學院韓際宏教授惠贈；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收和PCR產(chǎn)物回收試劑盒、opti-MEM轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、T4 DNA連接試劑盒、DNA Marker（Promega公司）；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ（Fermentas公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（HyClone公司）；聚乙二醇（sigma公司）；PCR擴增試劑盒（TaKaRa公司）；TRIzol試劑盒、Lipofectamine?3000試劑（Invitrogen公司）；SYBR Green實時定量PCR試劑盒（Roche公司）；CCK-8（日本同仁化學研究所）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 pLVX-mKLF4重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)GenBank中小鼠KLF4基因mRNA序列（NM_010637.3）設計引物，引物由中美泰和生物有限公司合成，上游引物5′-CGGAATTCATGAGGCAGCCACCTGG-3′；下 游 引物 5′-CGGGATCCTTAAAAGTGCCTCTTCATGTGT-3′。引物兩端引入酶切位點EcoRⅠ/BamHⅠ，擴增產(chǎn)物大小為1 470 bp。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃10 min。經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，并按PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明書對PCR產(chǎn)物片段進行提純回收。pLVX（pLVX-mCMV-ZsGreen-PGKPuro）質(zhì)粒和回收的PCR產(chǎn)物分別用EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后進行連接。按照T4 DNA連接酶試劑盒說明書進行連接，主要如下：pLVX質(zhì)粒雙酶切后產(chǎn)物1.5μL，PCR產(chǎn)物6μL，T4 DNA 連接酶 0.5μL，5×T4 DNA 連接酶緩沖液 2μL，16℃恒溫水浴箱中過夜。

1.2.2 pLVX-mKLF4重組質(zhì)粒的鑒定 產(chǎn)物pLVX-mKLF4轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，氨芐青霉素篩選培養(yǎng)，用無菌牙簽挑取單個的陽性菌落進行菌落PCR鑒定。對菌落PCR鑒定陽性的菌落通過LB培養(yǎng)基進行擴增，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書對擴增產(chǎn)物進行提取，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ/BamHⅠ對重組質(zhì)粒pLVX-KLF4進行雙酶切鑒定，酶切反應體系為10×Buffer 5 μL，DNA 1 μg，BamHⅠ（10 U/μL）1 μL，EcoRⅠ（10 U/μL）1μL，dH2O 補齊至 50μL，37℃孵育 15 min。同時將提取的DNA產(chǎn)物送測序公司（中美泰和生物有限公司）進行DNA測序。

1.2.3 Lenti-KLF4慢病毒的包裝 人胚腎上皮細胞株293T用高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、4 mmol/L L-谷氨酰胺），在37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。將重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pLVX-KLF4、慢病毒包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G按照Lipofectamine?3000說明書共同轉(zhuǎn)染細胞，簡述如下：對數(shù)生長期的293T細胞計數(shù)后接種于6孔板，每孔5×105個細胞，轉(zhuǎn)染時細胞密度達70%～80%融合。將含有上述3種質(zhì)粒的 DNA 溶液（摩爾比 1∶1∶1）共 18μg與 7.5μL Lipofectamine?3000制備轉(zhuǎn)染混合物。加入293T細胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時，以pLVX轉(zhuǎn)移質(zhì)粒作對照構(gòu)建Lenti-control慢病毒。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況，分別于48 h和72 h收集293T細胞上清液，4℃，4 000×g離心10 min，0.45μm一次性針頭濾器過濾，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 慢病毒的濃縮、純化及滴度測定 將5×PEG-8000 NaCl母液7.5 mL加入到30 mL過濾后的病毒液中，混合3～5次后；4℃放置過夜后于 4℃，離心（4 000×g，20 min）；吸棄上清，加入200μL的慢病毒溶解液，輕輕震蕩溶解沉淀；分裝儲存。取處于對數(shù)生長期RAW264.7細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板中（1×104個/孔），培養(yǎng)24 h至細胞密度達70%～80%融合時，準備病毒感染。按照倍比稀釋法，將濃縮后的病毒液80μL用12%高糖DMEM培養(yǎng)基進行倍比稀釋，梯度稀釋為5個濃度感染培養(yǎng)的RAW264.7細胞，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況。收集細胞過濾后，通過流式細胞儀（Cytomocs FC 500型流式細胞儀），根據(jù)熒光強度確定設門策略，F(xiàn)ITC陽性的細胞即為GFP陽性的細胞，檢測其陽性細胞比例，并根據(jù)公式［滴度數(shù)值（TU/mL）=細胞數(shù)量×陽性細胞數(shù)的比例（%）/加入病毒體積（mL）］計算病毒滴度［4］。

1.2.5 GFP陽性RAW264.7細胞的分選 取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞5×105個，加入含12%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基2 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取保存的病毒液4.1×108TU/mL稀釋后感染RAW264.7細胞，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，將培養(yǎng)基換成用含12%的胎牛血清、嘌呤霉素（2 mg/L）的高糖DMEM培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，72 h再通過分選流式細胞儀（BD FACS AriaⅢ）分選出GFP陽性的細胞。

1.2.6 RT-PCR檢測KLF4 mRNA的表達 細胞分組為WT組（野生型對照組）、Lenti-pLVX組（空載體對照組）和Lenti-KLF4組（慢病毒感染組），每組3孔細胞。分別提取分選后各組細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行PCR擴增，PCR引物同1.2.1，實驗重復3次；結(jié)果用2－ΔΔCt法對擴增結(jié)果進行分析。

1.2.7 流式細胞術（FCM）檢測細胞周期分布 分別將分選出的各組RAW264.7細胞計數(shù)后，接種于6孔板，每孔5×105個/2 mL，每組均設5個復孔，于培養(yǎng)24 h后，收集細胞，按照PI染液的說明書對細胞進行處理，過濾后立即上機檢測，實驗重復3次。

1.2.8 EdU法檢測細胞增殖活性 按照EdU細胞檢測試劑盒的操作說明書分別接種對數(shù)生長期的WT組、Lenti-pLVX組和Lenti-KLF4組細胞于12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種2×105個細胞，在培養(yǎng)48、96 h后，更換含10μmol/L EdU的培養(yǎng)基 1 mL，孵育1 h后，4%多聚甲醛固定15 min，0.5%Triton X-100室溫破膜20 min，加入click-reaction mixture（含1 mol/L pH=8.5 Tris-HCl 50 μL，25 mmol/L CuSO420 μL，10 mmol/L 6-FAM-Azide 2.5μL，0.5 mol/L抗壞血酸 50μL，去離子水補足體系至500μL）室溫避光孵育30 min，然后用DAPI染DNA，最后用Leica DMZ3000熒光顯微鏡觀察并采集圖像。每個樣本隨機讀取10個視野，細胞增殖率按照高倍視野下EdU陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比計算［5］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用Stata 14.1進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s法，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建pLVX-mKLF4質(zhì)粒 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建過程，見圖1A。將構(gòu)建好的pLVX-mKLF4質(zhì)粒進行擴增、純化、提取后進行雙酶切、PCR及測序驗證。以pLVX-mKLF4質(zhì)粒為模板進行引物PCR擴增，擴增片段大小約為1.5 kb，見圖1B。雙酶切后進行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示質(zhì)粒構(gòu)建成功，瓊脂糖凝膠電泳顯示，酶切后產(chǎn)生了2個條帶，大小分別約為1.5 kb和10 kb，見圖1C。

Fig.1 Construction and identification of pLVX-mKLF4 shuttle plasmd圖1 pLVX-mKLF4穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.2 pLVX-mKLF4質(zhì)粒的測序結(jié)果 經(jīng)雙酶切鑒定連接成功的質(zhì)粒DNA送測序公司測序，結(jié)果證實與GenBank中小鼠KLF4基因序列（NM_010637.3）序列一致。重組慢病毒載體pLVX-KLF4質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 慢病毒滴度檢測結(jié)果 倍比稀釋后的病毒感染RAW264.7，流式細胞術檢測結(jié)果，見表1。根據(jù)公式計算得出病毒滴度約為2.05×108TU/mL。

Tab.1 Percentages of GFP positive cells detected by flow cytometry表1 FCM測得不同體積病毒感染RAW264.7細胞后的GFP陽性細胞比例及FCM滴度

2.4 成功篩選GFP陽性RAW264.7細胞株 通過分選流式細胞儀將高表達GFP的細胞分選出來繼續(xù)培養(yǎng)，見圖2。

Fig.2 The GFP positive cells sorted by flow cytometry圖2 分選流式細胞儀分選出不同組GFP陽性的RAW264.7細胞

2.5 KLF4 mRNA的表達結(jié)果 WT組、Lenti-pLVX組、Lenti-KLF4組KLF4 mRNA表達水平分別為1.00±0.00、1.01±0.34、9.33±0.84，差異有統(tǒng)計學意義（F=214.262，P＜0.01），WT組和Lenti-pLVX 組差異無統(tǒng)計學意義，Lenti-KLF4組較WT組、Lenti-pLVX組KLF4 mRNA水平明顯升高（P＜0.01）。

2.6 KLF4過表達的RAW264.7細胞周期結(jié)果 與WT組和Lenti-pLVX組相比，Lenti-KLF4組的G0/G1期比例降低，S期比例（S Phase Fraction，SPF）增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），G2/M期差異無統(tǒng)計學意義；WT組與Lenti-pLVX組細胞周期分布差異無統(tǒng)計學意義，見表2。

Tab.2 Changes of cell cycle percentages detected by flow cytometry表2 流式細胞術檢測KLF4過表達的RAW264.7細胞周期的變化（n=3，%，±s）

Tab.2 Changes of cell cycle percentages detected by flow cytometry表2 流式細胞術檢測KLF4過表達的RAW264.7細胞周期的變化（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與 WT 組比較，b與 Lenti-pLVX 組比較，P＜0.05

2.7 EdU法檢測KLF4過表達的RAW264.7細胞增殖活性 細胞培養(yǎng)48、96 h后Lenti-KLF4組的細胞增殖活性高于WT組、Lenti-pLVX組（均P＜0.01），WT組、Lenti-pLVX組間差異無統(tǒng)計學意義，見圖 3、表3。

3 討論

慢病毒載體與其他逆轉(zhuǎn)錄載體相比具有以下優(yōu)勢：可以轉(zhuǎn)染處于不同分裂期的細胞；導入的目的基因可以在體外和體內(nèi)宿主細胞中得到長期而穩(wěn)定的表達；能夠兼容多個轉(zhuǎn)錄啟動子；可以容納外源基因的大小約10 kb左右［6-8］?；谏鲜鰞?yōu)點及小鼠KLF4基因的特點，本研究選擇構(gòu)建小鼠KLF4慢病毒表達載體。

Fig.3 The proliferation activities of RAW264.7 cells over-expressed KLF4 detected by EdU method圖3 EdU法檢測KLF4過表達的RAW264.7細胞增殖活性（×400）

Tab.3 EdU positive cell percentages detected by flow cytometry表3EdU陽性的KLF4過表達的RAW264.7細胞比例（n=3，%±s）

Tab.3 EdU positive cell percentages detected by flow cytometry表3EdU陽性的KLF4過表達的RAW264.7細胞比例（n=3，%±s）

＊＊P＜0.01；a與 WT 組比較，b與 Lenti-pLVX 組比較，P＜0.05

KLF4在胃腸道上皮細胞表達最為豐富，稱為胃腸 富 集 GKLF（gut-enriched Krüppel-like factor，GKLF），主要調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化，并參與局部炎癥反應［9］。其與不同的靶基因結(jié)合主要通過轉(zhuǎn)錄激活或抑制來發(fā)揮不同的生物學作用，故而能夠通過抑制或促進相關基因的表達在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起雙重作用，并影響預后［10-11］。有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮雙重作用，既能與靶基因結(jié)合進行負向調(diào)節(jié)，抑制癌基因的表達［12］，又可能與靶基因結(jié)合進行正向調(diào)節(jié)，促進癌基因的表達［13］。KLF4參與了對免疫細胞的表達和成熟的調(diào)節(jié)，KLF4對Th17細胞的分化起著重要的轉(zhuǎn)錄作用，是Th17細胞分化的一個重要調(diào)節(jié)因子。在敲除KLF4的小鼠體內(nèi)，Th17細胞數(shù)量明顯降低，而在成熟的T細胞中KLF4的表達量較高［14］。近年來研究表明，KLF4在機體炎性反應的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用，炎癥機制假說在肺纖維化發(fā)病過程中占據(jù)主導地位［15］。有研究發(fā)現(xiàn)氣管平滑肌細胞中某些miRNA的表達受到白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 或干擾素（IFN）-γ等炎性細胞因子刺激的影響，如miR-25可通過提高KLF4的表達水平來參與調(diào)控自噬細胞的炎性反應［16］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在機體內(nèi)表達水平升高會促進一氧化氮形成，進而來維持機體內(nèi)的抗炎微環(huán)境［17］。同時本課題小組研究發(fā)現(xiàn)，在博來霉素致小鼠肺纖維化模型中，KLF4的表達水平先上升，隨著炎性程度的升高呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，而隨著纖維化程度的升高呈現(xiàn)上調(diào)趨勢［18］。近年來單核/巨噬細胞的異質(zhì)性備受關注，本研究前期發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細胞的表型偏移參與了博來霉素誘導的實驗性肺纖維化的發(fā)生發(fā)展過程［19］。KLF4能夠作為單核細胞/巨噬細胞分化的標記分子，同時KLF4能促進M2型巨噬細胞極化，參與調(diào)節(jié)單核/巨噬細胞的異質(zhì)性［20］。由此可見，KLF4作為一種調(diào)節(jié)因子，在機體的腫瘤、免疫和炎癥等發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，深入研究KLF4基因?qū)⒂兄谶M一步了解KLF4參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。慢病毒載體作為有效的基因運載工具，將為研究KLF4提供重要的技術幫助。

本研究成功構(gòu)建了KLF4過表達慢病毒載體，可以通過其病毒顆粒感染目的細胞RAW264.7，篩選獲得穩(wěn)定高表達株，為后續(xù)的體內(nèi)體外研究中探討KLF4的作用機制奠定了實驗基礎。

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