植物乳桿菌K25發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖的影響因素及其應(yīng)用

姜云蕓, 蔡 淼, 邵淑娟, 付冰冰, 黎潤(rùn)坤, 李曉琬, 張 健, 楊貞耐,*

(1.北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室， 北京工商大學(xué)， 北京 100048； 2.菏澤市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院， 山東 菏澤 250014)

*楊貞耐，男，教授，博士，主要從事乳品科學(xué)及加工技術(shù)方面的研究，通信作者。

植物乳桿菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)可賦予發(fā)酵乳制品獨(dú)特的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，還具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤和調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等生物活性，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但是，植物乳桿菌EPS的產(chǎn)量偏低，而影響其產(chǎn)量的因素具有菌株特異性，有關(guān)添加植物乳桿菌EPS對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性影響的研究也較少。采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法確定了植物乳桿菌K25 產(chǎn)EPS 的優(yōu)化培養(yǎng)基組成：每升含胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g 和吐溫80 1.0 mL。優(yōu)化的發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)24 h和培養(yǎng)基初pH值6.5。在此條件下EPS 產(chǎn)量為250.21 mg/L。流變學(xué)研究表明，該EPS 水溶液的黏度具有隨著濃度和剪切速率升高而升高，以及剪切變稠的特性。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該EPS具有長(zhǎng)方形塊狀微觀結(jié)構(gòu)，有利于穩(wěn)定溶液的質(zhì)構(gòu)并保持水分。將該EPS 加入到酸性乳飲料中，進(jìn)一步驗(yàn)證了其具有良好的保水特性，表明植物乳桿菌K25產(chǎn)生的EPS可以作為一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的新型食品穩(wěn)定劑。

植物乳桿菌； 胞外多糖； 產(chǎn)量； 影響因素； 乳飲料

乳酸菌胞外多糖(extracellular polysaccharide，EPS)是菌體在其生長(zhǎng)代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的水溶性大分子糖類物質(zhì)，是細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。乳酸菌EPS可賦予發(fā)酵乳制品特殊的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，可以作為天然安全的食品級(jí)多糖類添加劑，具有增稠、穩(wěn)定、乳化、膠凝及持水等特性[1]。此外，EPS還具有調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和抑制病原菌等生物活性，可應(yīng)用于功能食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[2-6]。

一般來說，乳酸菌的EPS產(chǎn)量偏低，菌株產(chǎn)EPS的穩(wěn)定性欠佳[1,7-9]。培養(yǎng)基組分(碳源、氮源、微量元素及無機(jī)鹽等)和生長(zhǎng)條件(接種量、培養(yǎng)溫度、時(shí)間及發(fā)酵初始pH值等)影響EPS的最終產(chǎn)量[7-9]。據(jù)報(bào)道，乳酸菌以葡萄糖為碳源時(shí)，其EPS產(chǎn)量明顯高于其他碳源[7]。例如，干酪乳桿菌CGⅡ以葡萄糖為碳源時(shí)，EPS產(chǎn)量比半乳糖和乳糖作為碳源的產(chǎn)量高。氮源的添加有利于細(xì)胞生長(zhǎng)，增加菌體的密度，可以促進(jìn)菌體將糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為多糖[10]，例如，明串珠菌NRRLB-1146產(chǎn)EPS受蛋白胨和酵母粉的顯著影響[10]。溫度是影響菌體產(chǎn)EPS的重要因素之一[8-9]，溫度過高，導(dǎo)致菌體在培養(yǎng)過程中容易過早衰老而發(fā)生自溶現(xiàn)象，使菌體濃度下降，從而降低EPS產(chǎn)量。研究表明，菌體達(dá)到一定濃度時(shí)EPS開始合成[11]，溫度過低，生長(zhǎng)緩慢，使菌體濃度低而影響EPS的合成。培養(yǎng)基pH值的影響主要通過改變酶的活性來間接調(diào)控EPS的合成[8-9]。乳桿菌產(chǎn)EPS的最適pH值一般在5.8～6.0，較其他微生物偏低，但若pH值過低，會(huì)導(dǎo)致EPS的合成過程中失去異戊二烯類載體而受到抑制[8-9]。

前期研究表明，源于藏靈菇的一株產(chǎn)EPS植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)K25，其發(fā)酵乳對(duì)飼喂高脂飼料小鼠模型具有良好的降膽固醇功效，并可增加小鼠腸道內(nèi)乳酸桿菌的數(shù)量，還具有抗氧化作用[12-13]。該菌株在發(fā)酵乳冷藏期間，表現(xiàn)出較好的存活能力，并且不會(huì)造成發(fā)酵乳后酸化[14]。此外，該菌株所產(chǎn)EPS對(duì)變異鏈球菌菌膜的形成具有明顯抑制作用，其MIC值較低(1.25×107CFU/mL)，同時(shí)可以顯著降低變異鏈球菌的黏附率[15]。鑒于植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的優(yōu)良功能特性，本研究旨在探討該菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS的影響因素，優(yōu)化其發(fā)酵條件，提高EPS產(chǎn)量，同時(shí)進(jìn)一步研究此EPS作為天然的增稠劑和穩(wěn)定劑在酸性乳飲料中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要化學(xué)試劑和培養(yǎng)基

三氯乙酸(TCA)、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、鹽酸、氫氧化鈉、胰蛋白胨等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；透析袋(截流分子質(zhì)量為8 000～14 000 Da)，北京生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

半合成培養(yǎng)基(SDM)：胰蛋白胨10.0 g、YNB(酵母氮源)6.7 g、葡萄糖20.0 g、磷酸氫二鉀2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸鈉5.0 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1.0 mL，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.6，121 ℃滅菌15 min。

磷酸鹽緩沖液(PBS)：1.44 g Na2HPO4，0.24 g K2HPO4，0.2 g KCl，8 g NaCl，pH值7.4。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

植物乳桿菌K25菌株由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，保藏在含30%甘油的脫脂乳中，于-80 ℃冰箱保存。

1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLS-3750 型高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；CR21GⅢ型高速冷凍離心機(jī)，日本HITACHI 公司；真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；Elx800 型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；S20 型數(shù)顯pH 計(jì)，上海梅特利-托利多公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1菌株培養(yǎng)

植物乳桿菌K25在SDM液體培養(yǎng)基中活化，37 ℃培養(yǎng)12 h，連續(xù)活化兩代作為種子培養(yǎng)液。

1.4.2植物乳桿菌產(chǎn)EPS 的提取與測(cè)定[5]

植物乳桿菌K25發(fā)酵培養(yǎng)24 h 后，測(cè)定發(fā)酵液pH值以及600 nm下的吸光光度值OD600。發(fā)酵液中加入質(zhì)量濃度為800 g/L的三氯乙酸溶液，調(diào)節(jié)其質(zhì)量濃度至40 g/L，室溫下震蕩2～4 h。離心(10 000 r/min，4 ℃)30 min，除去菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)，取上清液。上清液中加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃條件下靜置12 h。離心30 min(10 000 r/min，4 ℃)，棄上清液。蒸餾水溶解沉淀，透析48 h，每8 h換一次水。

采用苯酚-硫酸法測(cè)定植物乳桿菌K25 EPS含量。以葡萄糖溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，490 nm下測(cè)吸光度，得到回歸線方程，見式(1)。

y=0.008 7x+0.023 2，R2=0.999 4。

(1)

取20 μL透析液稀釋至200 μL，加入100 μL的6%苯酚和500 μL濃硫酸混勻，靜置20 min，置于酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm下的吸光度。

1.4.3EPS的單因素實(shí)驗(yàn)

依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)選定的單因素為：碳源(果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖)、二價(jià)金屬離子(鈣、鎂、鐵、錳、銅、鋅)、鈉離子、氮源(蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、脫脂乳粉)、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH值。

1.4.4響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS影響顯著的3個(gè)因素(葡萄糖濃度、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH值)，以EPS產(chǎn)量作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。Design-Expert軟件設(shè)計(jì)中心組合試驗(yàn)，每組做3個(gè)平行樣品。

1.4.5掃描電鏡觀察

稱取5 mg EPS樣品于載玻片，用雙面膠均勻粘貼于云母表面，洗耳球吹去多余粉末和未帖服的樣品殘余，并在表面噴金(約10 nm)，在掃描電子顯微鏡scanning electron microscope(SEM)下觀察EPS樣品形態(tài)。

1.4.6EPS溶液流變學(xué)分析

分別配制0.3、0.5、1.0 mg/mL的EPS溶液，使用HAAKE MARS流變儀(CC16號(hào)轉(zhuǎn)子)分別測(cè)定其在不同剪切速率(0～300 r/s)以及不同溫度(0～70 ℃)條件下的流變學(xué)特性。

1.4.7含EPS的酸性乳飲料穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

配制含3.6%巴氏殺菌奶和5%蔗糖的料液，然后分別加入質(zhì)量比為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的EPS，果膠、CMC、羥丙基淀粉酯和大豆多糖，混合均勻。靜置冷卻到20 ℃ 以下，用檸檬酸(10%)調(diào)節(jié)pH值至5.5。均質(zhì)2 min置于牛奶瓶(50 mL/瓶)，巴氏殺菌(75 ℃，15 min)，室溫保存。

取調(diào)制好的飲料20 mL，記錄試管質(zhì)量m0和加入樣品后的質(zhì)量m1。離心(4 500 r/min，20 min)，棄去上清液，準(zhǔn)確稱量沉淀物質(zhì)量m2，利用式(2)計(jì)算保水率。

保水率=(m2-m1)/(m1-m0)×100%。

(2)

用布式流變儀測(cè)定各酸性乳飲料黏度，方法同1.4.6節(jié)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1培養(yǎng)條件對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響

1)發(fā)酵時(shí)間和溫度。以SDM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，測(cè)定分析不同的培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)植物乳桿菌K25 EPS產(chǎn)量的影響(圖1)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)(圖1a)。培養(yǎng)至24 h時(shí)，植物乳桿菌EPS 的產(chǎn)量達(dá)到最大值179.22 mg/L，隨后大幅度下降。這可能是由于發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體自溶釋放出分解代謝多糖的酶，從而使EPS降解，降低了EPS 產(chǎn)量[16-18]。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選取24 h為植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵時(shí)間。

發(fā)酵溫度對(duì)植物乳桿菌EPS 產(chǎn)量的影響如圖1b。 30 ℃時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值235.7 mg/L，但是隨著溫度的升高，EPS的產(chǎn)量下降。這可能與菌體合成多糖的酶活性在30 ℃時(shí)較高有關(guān)[16-17]，因此選擇30 ℃為植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的最佳發(fā)酵溫度。

圖1 發(fā)酵時(shí)間和溫度對(duì)植物乳桿菌 EPS 產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of fermentation time and temperature on yield of EPS from L. plantarum

2)培養(yǎng)基初始pH值。每株菌都有最適合自身生長(zhǎng)和產(chǎn)EPS的pH值范圍，此范圍內(nèi)pH值能夠最大程度地提高酶促反應(yīng)速率，進(jìn)而使微生物的生長(zhǎng)和合成代謝速率達(dá)到最大值[19]。培養(yǎng)基初始pH值(分別為5.5、6.5、7.5、8.5、9.0)對(duì)植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的影響如圖2。隨著培養(yǎng)基初始pH值的增加，EPS產(chǎn)量呈現(xiàn)出先增大后減小的變化，當(dāng)pH值為6.5時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)到最大值198.4 mg/L，因此選擇植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的最適初始pH值為6.5。

圖2 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)植物乳桿菌EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH of culture medium on yield of EPS from L. plantarum

2.1.2培養(yǎng)基成分對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響

碳源是微生物生長(zhǎng)代謝重要的營(yíng)養(yǎng)物之一，主要提供細(xì)胞合成產(chǎn)物的碳架及代謝所需的能量[18,20-21]。由于不同微生物的碳水化合物代謝酶系不同，因此其可利用的碳源也不同，常用的碳源有糖類(一般使用果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖)、油脂、有機(jī)酸、有機(jī)酸酯和小分子醇等[18,20-21]。本實(shí)驗(yàn)選擇果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和葡萄糖研究不同碳源對(duì)植物乳桿菌K25 EPS 產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，以葡萄糖為碳源時(shí)EPS 的產(chǎn)量最大(圖3a)。因此選擇葡萄糖為植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的最佳碳源，且其質(zhì)量濃度為15 g/L時(shí)，EPS產(chǎn)量達(dá)最大值為235.4 mg/L(圖3b)。

圖3 碳源對(duì)植物乳桿菌EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbonsource on EPS yield of L. plantarum

圖4 氮源對(duì)植物乳桿菌EPS 產(chǎn)量的影響 Fig.4 Effect of nitrogen source on EPS yield of L. plantarum

氮源能夠?yàn)榫w生長(zhǎng)代謝提供氮素，組成生物體的核酸、蛋白質(zhì)及其他氮素化合物，是影響植物乳桿菌EPS產(chǎn)量的主要因素之一[8]。本實(shí)驗(yàn)選用大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、脫脂乳粉和牛肉膏作為氮源，考察氮源對(duì)K25產(chǎn)EPS的影響，結(jié)果如圖4a。由圖4a可知，大豆蛋白胨作為氮源時(shí)EPS產(chǎn)量最高，為218.3 mg/L，其他依次為胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏和脫脂乳粉，因此，選擇大豆蛋白胨作為植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的最佳氮源。

以SDM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用大豆蛋白胨代替胰蛋白胨，添加量分別為0、2、4、8、12 g/L，結(jié)果如圖4b。由圖4b可見，隨著大豆蛋白質(zhì)量濃度增加，可供菌體利用的氮源增加，當(dāng)大豆蛋白胨質(zhì)量濃度為8 g/L時(shí)，EPS 產(chǎn)量達(dá)到最大值192.7 mg/L。繼續(xù)增加大豆蛋白胨濃度，反而抑制菌體生長(zhǎng)，這可能是高濃度的氮源對(duì)菌體產(chǎn)生滲透壓脅迫[8]，因此大豆蛋白胨的最適質(zhì)量濃度為8 g/L。

金屬離子是維持多相體系的滲透平衡的重要組成部分，也是大部分酶，尤其是金屬酶類反應(yīng)的必要組成部分[22]。據(jù)報(bào)道，培養(yǎng)基中的金屬離子能影響植物乳桿菌的生長(zhǎng)代謝，并能通過影響相關(guān)的酶活性，或者改變培養(yǎng)基的滲透壓、pH值和氧化還原電位等因素來影響EPS的生成[22]。培養(yǎng)基中缺乏有關(guān)微量元素時(shí)會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)速度，但過量時(shí)又會(huì)產(chǎn)生毒害作用[22]，因此有必要控制培養(yǎng)基中金屬離子的種類以及比例，確保菌體有效地產(chǎn)生EPS。本實(shí)驗(yàn)研究了7種金屬離子對(duì)EPS產(chǎn)量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，正二價(jià)鐵離子對(duì)EPS產(chǎn)量的影響最明顯(p<0.05)，添加量為1.0 g/L時(shí)，植物乳桿菌EPS產(chǎn)量達(dá)218.6 mg/L。

圖5 金屬鹽離子對(duì)植物乳桿菌EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of metal ions on yield of EPS from L. plantarum

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)碳源、二價(jià)金屬離子、氮源、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH值的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定能夠顯著影響植物乳桿菌EPS 產(chǎn)量的因素為：葡萄糖(15 g/L)、發(fā)酵溫度(30 ℃)、培養(yǎng)基初始pH值(6.5)。以EPS產(chǎn)量作為響應(yīng)面值，選取葡萄糖濃度、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH值3個(gè)因素，設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表，見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

根據(jù)BBD原理，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。使用Design-Expert 響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件分析，共有17 個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，以葡萄糖糖濃度、發(fā)酵溫度、初始pH值為自變量，以EPS 產(chǎn)量為響應(yīng)值。在不同條件下所得的多糖產(chǎn)量見表2。根據(jù)表2結(jié)果，由Design Expert(Version 8.0.6) 軟件獲得擬合方程，見式(3)。

(3)

式(3)中，Y是EPS產(chǎn)量，X1是葡萄糖質(zhì)量濃度，X2是溫度，X3是pH。

方差分析和模型以及各參數(shù)分析如表3?；貧w診斷表示模型的F值為7.36，而p值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.01，

表2 Design-Expert設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

** 為較顯著(p<0.01)，*為顯著(p<0.05)。

2.3 響應(yīng)面交互作用分析

3個(gè)顯著因素(葡萄糖質(zhì)量濃度、pH值和發(fā)酵溫度)的交互影響對(duì)響應(yīng)值植物乳桿菌EPS的產(chǎn)量的影響可以從圖6至圖8的響應(yīng)面圖和等高線圖直接看出。圖6至圖8表示X1、X2、X3中任意的一個(gè)影響因素取零水平時(shí)，剩下的兩個(gè)變量影響因素對(duì)EPS產(chǎn)量的交互影響。響應(yīng)面的平面投影和等高線的形狀可以表明交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形則表示兩因素交互影響的作用顯著，而圓形則表明交互作用較弱。

由圖6可以得出，pH值和葡萄糖濃度的等高線圖呈現(xiàn)橢圓形，則說明二者交互作用比較顯著。隨著葡萄糖濃度的升高，EPS產(chǎn)量也隨之提高。培養(yǎng)基初始pH值會(huì)對(duì)菌體的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生較大影響。初始pH值不同時(shí)，植物乳桿菌的生長(zhǎng)情況不同，從而對(duì)葡萄糖的利用程度及EPS產(chǎn)量影響也不同。

圖6 葡萄糖質(zhì)量濃度和初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contours map of effects of glucose concentration and pH on EPS yield

圖7 葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour map of effects of glucose concentration and fermentation temperature on EPS yield

由圖7可以得出，葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度的等高線呈現(xiàn)橢圓形，說明葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度之間的交互作用比較顯著。將發(fā)酵初始pH值控制為零時(shí)，葡萄糖的濃度設(shè)定為固定值，隨著發(fā)酵溫度的不斷升高，EPS的產(chǎn)量先增大后減小。分析等高線圖中葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度變化的密集度可看出發(fā)酵溫度的等高線比較密集，發(fā)酵溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響比葡萄糖濃度要大。隨著葡萄糖濃度的增加，用于合成EPS的原料也就不斷地增加，但是葡萄糖過多，會(huì)產(chǎn)生滲透壓，進(jìn)而抑制菌株的生長(zhǎng)，導(dǎo)致EPS產(chǎn)量下降；同時(shí)如果發(fā)酵溫度也發(fā)生變化，就會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速度從而影響其對(duì)葡萄糖的利用，也許這就是葡萄糖濃度和發(fā)酵溫度的交互作用比較顯著的原因。

由圖8可以得出，發(fā)酵溫度和發(fā)酵初始pH值的等高線圖接近于圓形，即說明二者之間的交互作用并不顯著。固定葡萄糖濃度為零，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時(shí)，隨著初始pH值減小，EPS產(chǎn)量逐漸增大。

圖8 發(fā)酵溫度和初始pH值對(duì)EPS產(chǎn)量影響的等高線及響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface and contour map of effects of fermentation temperature and pH on EPS yield

通過軟件分析得出植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)EPS 有最大值，其發(fā)酵的優(yōu)化條件為：葡萄糖質(zhì)量濃度20 g/L、初始pH值6.5、發(fā)酵溫度30 ℃，在此條件下植物乳桿菌EPS 產(chǎn)量的擬合函數(shù)值為245.30 mg/L。利用得到的優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，得到EPS產(chǎn)量為250.21 mg/L，與預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。

圖9 不同質(zhì)量濃度的EPS溶液在不同的剪切速率和溫度下的黏度變化Fig.9 Viscosity change of EPS solution affected by different shear rate and different temperature

2.4 EPS的流變學(xué)特性

乳酸菌EPS作為一種天然的食品添加劑用于發(fā)酵乳制品，不僅能夠增添良好的口感和風(fēng)味，還可以改善乳制品的質(zhì)構(gòu)[16]。使用乙醇沉淀法得到EPS。分別研究在不同溫度和轉(zhuǎn)數(shù)條件下EPS水溶液的流變學(xué)特性，結(jié)果如圖9。不同剪切速率下的黏度圖(圖9a)表明，EPS溶液的黏度隨著EPS質(zhì)量濃度的升高而升高，不同EPS質(zhì)量濃度的EPS溶液黏度與剪切速率呈正相關(guān)，即隨著剪切速率的升高而升高，體現(xiàn)為增稠特性[23]。EPS溶液的黏度隨著溫度的升高而下降(圖9b)，原因可能是高溫使EPS分子原有的結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則，呈現(xiàn)一種相對(duì)稀松的分子構(gòu)象，降低了EPS分子間的接觸面積和頻率，在EPS分子內(nèi)部也會(huì)發(fā)生分子重排現(xiàn)象，破壞了結(jié)構(gòu)的完整性[23]。

2.5 EPS微觀結(jié)構(gòu)分析

掃描電鏡是研究EPS微觀結(jié)構(gòu)的有效手段，對(duì)于EPS微觀結(jié)構(gòu)的了解可以為進(jìn)一步研究EPS對(duì)食品質(zhì)構(gòu)的影響提供重要依據(jù)。植物乳酸菌EPS 的SEM 圖像如圖10。植物乳桿菌EPS呈現(xiàn)大小不一、外形近似長(zhǎng)方體并緊湊疊加的微觀結(jié)構(gòu)，表面較為光滑。這種結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，賦予了EPS特殊的流變學(xué)性質(zhì)，例如提升產(chǎn)品的黏度、改善質(zhì)構(gòu)和保水特性[24]。

圖10 植物乳桿菌EPS掃描電鏡圖Fig.10 SEM image of EPS from L. plantarum

2.6 EPS在酸性乳飲料中應(yīng)用的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

酸性乳飲料中分別加入植物乳桿菌EPS、果膠、羧甲基纖維素(CMC)、羥丙基淀粉酯和大豆多糖，

巴氏殺菌后，通過測(cè)定溶液的保水率來評(píng)估其穩(wěn)定性[16]，結(jié)果如圖11a。由圖11a可見，果膠的保水作用，隨其質(zhì)量比的升高而增強(qiáng)，較其他穩(wěn)定劑表現(xiàn)出更好的保水作用。CMC、羥丙基淀粉酯和大豆多糖的保水作用也隨其質(zhì)量比的增加而增強(qiáng)，但是，添加了CMC、羥丙基淀粉酯、大豆多糖或EPS的酸性乳飲料，它們之間的保水率沒有明顯差異。EPS對(duì)酸性乳飲料的穩(wěn)定保水作用，在其質(zhì)量比達(dá)到0.5% 時(shí)最強(qiáng)。

從圖11b中可知，乳飲料的黏度隨果膠添加量的增加而明顯增大，而添加等量的大豆多糖的乳飲料黏度沒有明顯變化，且隨其添加量的增加也變化不大。羥丙基淀粉酯表現(xiàn)出明顯的增稠效果，但隨其添加量增加，黏度下降。CMC和EPS的穩(wěn)定效果最為理想，添加了二者的乳飲料黏度總體變化不大，而且隨著EPS添加量的增加，黏度先下降后上升, EPS質(zhì)量比為0.2% 時(shí)效果最佳。在酸性乳飲料體系中，EPS與酸和蛋白等物質(zhì)之間發(fā)生較復(fù)雜的相互作用，并協(xié)同影響發(fā)酵乳飲料的理化性質(zhì)[25]。

圖11 EPS和穩(wěn)定劑添加量對(duì)酸性乳飲料的保水性和黏度影響Fig.11 Effect of concentrations of EPS and stabilizers on water retention and viscosity of acid milk beverage

果膠和羥丙基淀粉酯的使用易導(dǎo)致酸性乳飲料過于黏稠。大豆多糖具有良好的保水性，但是對(duì)產(chǎn)品的黏度沒有明顯的改善作用。EPS表現(xiàn)出很大的潛能，具有良好的穩(wěn)定性，選擇適當(dāng)?shù)臐舛忍砑?，酸性乳飲料不易產(chǎn)生過稠現(xiàn)象，EPS 在食品加工中作為穩(wěn)定劑具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法分析，對(duì)一株源自傳統(tǒng)藏靈菇的植物乳桿菌K25產(chǎn)EPS的條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為每升含胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖20 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸鈉5.0 g、硫酸鎂 0.2 g、硫酸錳 0.05 g、吐溫80 1.0 mL；優(yōu)化的發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)24 h和培養(yǎng)基初pH值6.5。在此條件下植物乳桿菌K25 的EPS產(chǎn)量達(dá)250.21 mg/L。對(duì)EPS 流變學(xué)特性的研究結(jié)果表明，該EPS 溶液的黏度隨著濃度和剪切速率的增加而增加，隨著溫度增加而降低，不同于多數(shù)乳酸菌EPS具有的剪切變稀現(xiàn)象。采用掃描電鏡觀察EPS分子形態(tài)，表明該EPS 具有近似方塊并緊密疊加的立體微觀結(jié)構(gòu)。將EPS添加于酸性乳飲料中，該產(chǎn)品的穩(wěn)定性和黏度與添加CMC 的酸性乳飲料相接近。因此植物乳桿菌K25所產(chǎn)的EPS 具有作為天然食品穩(wěn)定劑應(yīng)用的潛力。

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