食品中蠟樣芽胞桿菌實(shí)時(shí)熒光RPA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

劉立兵， 南匯珠， 孫曉霞， 姜彥芬， 王金鳳， 王建昌,*

(1.河北出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心， 河北 石家莊 050051； 2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院， 河北 石家莊 050051)

*王建昌，男，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事食源性微生物、動(dòng)物疫病分子生物學(xué)方面的研究，通信作者。

蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)是革蘭氏陽(yáng)性兼性厭氧菌，是食品污染常見的致病菌之一[1]，具有代謝通路多樣化、營(yíng)養(yǎng)需求低的特點(diǎn)[2-3]。人體感染后臨床癥狀有惡心、嘔吐、腹痛以及腹瀉等[4]，食物中毒的發(fā)病率高達(dá)60%～100%[5]。探索簡(jiǎn)便、快速、高靈敏性的檢測(cè)方法是該菌研究的重點(diǎn)。

蠟樣芽胞桿菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法操作過程繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要經(jīng)驗(yàn)豐富的操作人員。張志鴻等[6]建立real-time PCR方法檢測(cè)食品中的產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽胞桿菌，周巍等[7]通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)對(duì)酸乳中的蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行檢測(cè)，賈雅菁等[8]在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光染料，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蠟樣芽胞桿菌的定性熒光監(jiān)測(cè)；但上述方法都不能滿足簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)特點(diǎn)。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amp-lification, RPA)因其操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速、不需要昂貴的設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，在醫(yī)療診斷、轉(zhuǎn)基因食品和動(dòng)物疫病檢測(cè)中受到廣泛關(guān)注[9]。RPA技術(shù)主要依賴于重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和具有鏈置換活性的DNA聚合酶在恒溫條件下(25～42 ℃)進(jìn)行，而實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增(real-time recombinase polymerase amplification，real-time RPA)技術(shù)將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)與熒光探針結(jié)合，具備了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程的優(yōu)勢(shì)，靈敏度和特異性也進(jìn)一步提高，已被廣泛運(yùn)用于細(xì)菌、病毒及寄生蟲的檢測(cè)[10]。但截至目前利用該方法檢測(cè)蠟樣芽胞桿菌的研究未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂(MYP)、營(yíng)養(yǎng)肉湯，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；Premix Ex Taq，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；RAA試劑盒(熒光型)，購(gòu)自浙江泰晶生物科技有限公司。

Genie Ⅲ型等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，英國(guó)OptiGene公司；ABI7500型實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國(guó)ABI公司；NanoDrop 2000C型超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

實(shí)驗(yàn)所用的菌株見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株

+，陽(yáng)性；-，陰性。

1.3 細(xì)菌基因組DNA的提取

將蠟樣芽胞桿菌(CICC63301)純培養(yǎng)菌接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)16 h。取1 mL菌液10 000 r/min離心1 min，棄上清液，將菌體沉淀按照細(xì)菌DNA提取試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，立即使用或-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)使用NanoDrop 2000C型超微量分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度。

1.4 引物探針設(shè)計(jì)

參考GenBank中蠟樣芽胞桿菌16S RNA基因序列(登錄號(hào)：KY224970.1)，選擇保守區(qū)域，設(shè)計(jì)real-time RPA引物及exo探針，目的片段大小為297 bp。用于蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的real-time PCR引物及探針參照文獻(xiàn)[11]中相關(guān)序列(表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物及探針

1.5 Real-time RPA方法的建立

使用RAA試劑盒(熒光型)配制單個(gè)反應(yīng)體系，其中10 μmol/L的RPA-F和RPA-R各2 μL(終濃度0.4 μmol/L)，10 μmol/L exo probe 0.6 μL(終濃度0.12 μmol/L)，A buffer 12.5 μL，模板1 μL，ddH2O 29.4 μL。將上述47.5 μL溶液混勻后加入到裝有凍干酶制劑的反應(yīng)管中，用移液器上下吹打至完全溶解，向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer(280 mmol/L MgAc)，瞬時(shí)離心并渦旋后放入Genie III中39 ℃反應(yīng)20 min。

1.6 Real-time PCR方法

用于蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)的real-time PCR反應(yīng)按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，反應(yīng)體系為25 μL。其中Premix Ex Taq 12.5 μL，10 μmol/L PCR-F和PCR-R各1.5 μL(終濃度0.6 μmol/L)，5 μmol/L PCR-probe 1 μL(終濃度0.2 μmol/L)，模板1 μL，ddH2O 7.5 μL。將上述體系充分混勻后放入ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光PCR儀中，反應(yīng)程序設(shè)置為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃延伸 35 s，35個(gè)循環(huán)，60 ℃收集熒光信號(hào)。

1.7 特異性和靈敏性實(shí)驗(yàn)

以表1中所示菌株的基因組DNA作為模板進(jìn)行real-time RPA反應(yīng)，確定是否出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線。將蠟樣芽胞桿菌基因組DNA使用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋，以不同稀釋度的DNA作為模板進(jìn)行real-time RPA反應(yīng)，確定該方法的靈敏性。同時(shí)與已建立的real-time PCR方法的靈敏性進(jìn)行比較。

1.8 人工污染樣品檢測(cè)

蠟樣芽胞桿菌(CICC63301)經(jīng)過純培養(yǎng)后，用生理鹽水稀釋至濃度約為1.1麥?zhǔn)蠞岫?，進(jìn)行10倍梯度稀釋。將不同稀釋度的菌液1 mL分別添加到25 g大米飯樣品中(樣品預(yù)先按照GB 4789.14—2014檢測(cè)，未檢出蠟樣芽胞桿菌)，再添加到225 mL PBS中，用拍擊式均質(zhì)器連續(xù)均質(zhì)1～2 min，分別取1 mL模擬樣品，采用稀釋平板法，測(cè)定其活菌添加范圍為1.5×102～1.5×107CFU/g，同時(shí)從中各取1 mL模擬樣品參照1.3進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，取1 μL作為模板進(jìn)行檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 特異性實(shí)驗(yàn)分析

對(duì)蠟樣芽胞桿菌和其他細(xì)菌基因組DNA(濃度均為100 ng/μL)作為模板進(jìn)行real-time RPA檢測(cè)，結(jié)果表明僅蠟樣芽胞桿菌呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性結(jié)果，而其他芽胞桿菌和非芽胞桿菌細(xì)菌均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(表1)。表明該方法具有良好的特異性。

2.2 靈敏性實(shí)驗(yàn)分析

將濃度為100 ng/μL的蠟樣芽胞桿菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，連續(xù)稀釋8個(gè)梯度后，取每個(gè)梯度的核酸進(jìn)行real-time RPA和real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，real-time RPA的檢測(cè)限為1.0×10-3ng/μL(圖1a)，同real-time PCR方法檢測(cè)限一致(圖1b)。

1) 1.0×102, 2) 1.0×101, 3) 1.0×100, 4) 1.0×10-1, 5) 1.0×10-2, 6) 1.0×10-3, 7) 1.0×10-4, 8) 1.0×10-5；單位ng/μL。圖1 蠟樣芽胞桿菌靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Sensitivity of real-time RPA and real-time PCR for Bacillus cereus

2.3 人工污染樣品的檢測(cè)分析

人工污染蠟樣芽胞桿菌的大米飯的檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)污染量≥1.5×104CFU/g時(shí)，real-time RPA即可檢出大米飯中蠟樣芽胞桿菌，所需要時(shí)間僅為6～13 min；當(dāng)污染量≥1.5×105CFU/g，real-time PCR方可檢出大米飯中蠟樣芽胞桿菌，所需時(shí)間在30 min以上(Ct值為20～31)。結(jié)果說明，在檢測(cè)人工污染樣品時(shí)real-time RPA的靈敏性高于real-time PCR，同時(shí)前者所需時(shí)間明顯少于后者(表3)。

表3 蠟樣芽胞桿菌人工污染樣品檢測(cè)結(jié)果

—:未檢出。

3 討論與結(jié)論

研究選取蠟樣芽胞桿菌的16S RNA基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立了食品中蠟樣芽胞桿菌的real-time RPA快速檢測(cè)方法，即39 ℃恒溫反應(yīng)20 min實(shí)現(xiàn)對(duì)蠟樣芽胞桿菌的有效擴(kuò)增。方法特異性良好，靈敏性可達(dá)到1.0×10-3ng/μL，與real-time PCR檢測(cè)方法一致。對(duì)人工污染的大米飯，real-time RPA在反應(yīng)時(shí)間上明顯少于real-time PCR方法。該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速，為食品中蠟樣芽胞桿菌污染的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)方法。

目前已報(bào)道的蠟樣芽胞桿菌檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)法、普通PCR、多重PCR、熒光PCR、LAMP及基因芯片等[12-14]，但是分離培養(yǎng)法和基因芯片技術(shù)操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；PCR技術(shù)不僅對(duì)環(huán)境要求高，而且需要昂貴的PCR儀器和熟練的技術(shù)人員。上述方法在突發(fā)食物中毒等公共衛(wèi)生事件中的應(yīng)用有諸多不便[15-16]。研究建立的real-time RPA方法與real-time PCR相比，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)使用的OptiGene Ⅲ等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)緊湊小巧，輕便耐用，僅為1.75 kg左右，觸摸屏操作，無需連接電腦，其內(nèi)置長(zhǎng)航時(shí)鋰電池，可在無電源環(huán)境中全天戶外工作，可實(shí)現(xiàn)便攜式的致病菌現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。雖然LAMP和real-time RPA均屬于等溫檢測(cè)方法，但LAMP反應(yīng)溫度較高(>60 ℃)，反應(yīng)時(shí)間一般在45～60 min[7]，并且實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，需要設(shè)計(jì)4～6條引物；而real-time RPA擴(kuò)增在常溫下(25～42 ℃)即可實(shí)現(xiàn)，且一般在20 min內(nèi)即可完成，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅需要2條引物和1條探針，并且RPA試劑為凍干粉形式，可實(shí)現(xiàn)常溫下運(yùn)輸，從而為蠟樣芽胞桿菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)提供了有價(jià)值的參考方法。

研究中real-time RPA方法的建立，結(jié)合細(xì)菌核酸的快速提取，可以達(dá)到現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的目的，為食品加工質(zhì)量控制及食源性疫病等公共衛(wèi)生事件中蠟樣芽胞桿菌的檢測(cè)提供了可借鑒的技術(shù)手段。

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