青霉素作用機制的研究進展及其假說

韋朝華 俞黎黎 霍江華 錢炳俊

摘 要：青霉素是臨床使用范圍較廣，效果好且經濟的一種抗生素?；谇嗝顾氐淖饔梦稽c，人們認為青霉素對革蘭陽性菌的效果較好，但同時臨床試驗發(fā)現對革蘭陰性球菌同樣有較好的效果，但對革蘭陰性桿菌的抗菌效果較差，那么它的殺菌機理到底如何？本文就目前對青霉素作用機制的研究現狀做出分析和探討。

關鍵詞：青霉素 作用機制 研究進展

中圖分類號：R74 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2018）07（a）-0230-04

自從英國科學家Fleming1929年發(fā)現青霉素并用于臨床后[1]。青霉素此后一直在細菌感染疾病方面的治療有較好的臨床效果和廣泛的臨床應用，它的研制使得人類進入了抗生素時代，開創(chuàng)了用抗生素治療疾病的新紀元。因為細菌細胞壁是它的特殊作用位點，使得青霉素如今仍然居于不可替代的地位。青霉素作為β-內酰胺類抗生素的一員，能抑制細胞壁的合成。在低滲環(huán)境下，細菌會自發(fā)吸入外界的水分，發(fā)生膨脹，而細胞壁就好像是高壓鍋的“鎖”，防止細菌炸裂。一旦細胞壁發(fā)生缺陷，就好像是高壓鍋突然失去了安全保護，細菌自然就會發(fā)生漲裂，從而死亡。然而人體組織與培養(yǎng)基不一樣。研究人員發(fā)現，在組織中，細菌往往處于一個等滲的狀態(tài)。換句話說，即便它們的細胞壁被破壞了，這些細菌也不大會發(fā)生裂解。有意思的是，青霉素等β-內酰胺類抗生素并沒有對此束手無策。相反，這些抗生素能用其他手段防止細菌增長，并讓它們死亡。研究人員認為，這或許和氧化帶來的損傷，或是細胞壁前體通路循環(huán)受阻有關。當前，對青霉素作用機制及細菌的耐藥機制研究日益豐富，新的細菌耐藥機制及新的抗生素作用機制的發(fā)現，是指導臨床和非臨床抗生素合理應用以及發(fā)現新型抗生素的基礎[2-3]。但β-內酰胺類抗生素的作用機制是一個多步驟而復雜的問題，對其殺菌機制仍是目前研究熱點。

基于青霉素的作用位點認為青霉素對革蘭陽性菌的效果較好，但同時臨床試驗發(fā)現對革蘭陰性球菌同樣有較好的效果，但對革蘭陰性桿菌的抗菌效果較差，那么它的殺菌機理到底如何？本文就目前對青霉素作用機制的研究現狀做出分析和探討。

1 目前研究近況與分析

近年來對青霉素作用機制的研究工作廣泛深入的開展，基于研究的成果，目前分為三個時期。

1.1 基于青霉素臨床效果的研究

自發(fā)現青霉素以來，人們對其作用機制研究的第一階段的主要成果歸結于藥敏實驗和臨床應用的觀察，有3個重要的早期研究結果[4]：⑴發(fā)現青霉素對革蘭陽性菌的作用效果要優(yōu)于革蘭陰性菌；⑵發(fā)現青霉素對正在增殖的細菌殺菌效果較好而對靜止期的細菌無效，說明其殺菌機制應為在細菌增殖時對其發(fā)生干擾；⑶發(fā)現青霉素能夠誘導細胞形態(tài)的改變，目前解釋為干擾了細胞壁的代謝破壞了其完整性所致[5]。比格認為青霉素殺死了處于分裂期的球 菌，而對不分裂的個體則沒有影響。于是，比格提出間歇性地加入青霉素，希望這些“頑固者”能在加藥間歇期開始分裂從而被下一劑青霉素殺死。研究發(fā)現在低濃度的青霉素中，球菌膨脹到正常體積的三倍而不分裂，桿菌也表現出類似的變化。托德在關于青霉素溶菌作用實驗的報道中也引用了這一研究和其他研究結果。在用I型、II型和III型肺炎雙球菌、綠色鏈球菌、溶血鏈球菌、葡萄球菌和韋氏梭菌進行的研究中，他發(fā)現所用的這些菌株都被青霉素溶解了，然而像大腸桿菌和綠膿桿菌等對青霉素具有抗性的細菌則不被溶解。但是他認為青霉素不通過溶菌作用也能殺死細菌。當溶菌發(fā)生時，其速率取決于細菌增殖的實際速率或潛在速率?！翱磥硪志?、殺菌和溶菌可能是同一過程中依次進行的不同階段?！弊羁斓娜芫俣瘸霈F在增殖速率最大的細菌中。這也許就是青霉素如此有效的真正原因，也就是說，培養(yǎng)時間不長的增殖活躍的細菌更易受到溶菌作用影響，雖然這時細菌最容易侵入人體，但是同時也最容易被溶解。

1.2 基于細菌的形態(tài)學研究

第二階段的主要研究成果是隨著對細菌細胞壁組成成分的了解而取得的。革蘭陽性細胞壁由肽聚糖和胞壁酸構成，革蘭陰性菌細胞壁由肽聚糖和外膜構成。革蘭陽性菌的肽聚糖由聚糖支架、四肽側鏈和五肽交聯(lián)橋三部分組成，革蘭陰性菌肽聚糖由聚糖支架和四肽側鏈兩部分組成。聚糖支架由N-乙酰葡萄糖胺（N-acetyl glucosamine）和N-乙酰胞壁酸（N-acetylmuramic acid）交替間隔排列，以β-1，4糖苷鍵連接而成；每個胞壁酸分子上連接一條四肽側鏈，革蘭陽性菌四肽側鏈通過五肽交聯(lián)橋相互連接，構成堅韌的三維立體框架結構。與革蘭陽性細菌不同的是，革蘭陰性菌的四肽側鏈與相鄰四肽側鏈直接連接，缺少五肽交連橋，形成較疏松的二維網狀結構。

1965年Strominger等[6]在這階段做出了重要貢獻，提出D-丙氨酰-D-丙氨酸立體構型酷似青霉素（見圖1），青霉素的作用機制可能是抑制了黏肽交聯(lián)過程中轉肽反應，轉肽酶因而誤認青霉素為其底物，因為青霉素分子與乙酰-D-Ala-Ala的分子結構類似，競爭性地與酶的活性中心結合，當酶和青霉素通過酰化反應被不可逆地交聯(lián)在一起時（見圖2），酶即失活，致使細菌細胞壁合成中的交聯(lián)反應中斷，從而阻止細胞壁肽聚糖交聯(lián)的形成，細菌由于細胞壁的破壞而死亡[7]。所以在早期研究青霉素作用中，發(fā)現當金黃色葡萄球菌在節(jié)基青霉素存在下培養(yǎng)，其細胞壁含有的D-丙氨酸比正常情況下多，這可能就是轉肽酶與青霉素結合引起的結果[8]。

青霉素能自由通過革蘭陽性菌的細胞壁，而青霉素只有通過革蘭陰性菌的細胞壁一是通過直接在膜的類脂相擴散，二是外膜上的膜孔道蛋白進入，是進入革蘭陰性菌的主要途徑。青霉素作為治療革蘭陰性球菌尤其是奈瑟菌屬的首選藥，作用在交聯(lián)反應中競爭性結合相鄰的氨基上，從而使細菌細胞壁合成障礙繼而死亡，但究其細胞壁結構，革蘭陰性菌沒有五肽交聯(lián)橋，不參與肽聚糖的交聯(lián)反應，那么青霉素對革蘭陰性球菌如淋病奈瑟菌的作用機制是如何呢，是否其作用不僅僅是與轉肽酶結合還有可能在四肽側鏈丙氨酸的合成上，而且實驗證明青霉素對大腸埃希菌的作用效果不好。但與此同時也會產生其他猜想-青霉素對革蘭陰性球菌仍然有較好的效果，是不是球菌與桿菌的形態(tài)學差異導致其不同耐藥性的不同，所以理解它們的細胞壁的合成過程是至關重要的。這種認識不僅在細胞形成和分裂的環(huán)境中很重要，而且在目前抗生素耐藥性的大環(huán)境中也很重要，因為細胞壁合成是β-內酰胺類抗生素的靶標，對細菌形態(tài)形成的有價值的認識表明，對形態(tài)學上不同的生物體進行比較研究，包括臨床相關的病原體，以更好理解細菌的生長與分裂，而這些需進一步研究驗證[9]。

細菌的形狀是由細胞壁決定的，并且可以是非常多樣化的。即使是在球菌的屬中，也有不同的形狀存在。例如，葡萄球菌或奈瑟菌細胞是真正的圓型，鏈球菌，乳酸球菌，或腸球菌都有卵形。有趣的是，有機體的形狀與它的一組青霉素結合蛋白之間似乎存在著某種聯(lián)系，這種酶是細胞壁的主要組成部分——肽聚糖。雖然只有一個肽聚糖生物合成機械似乎存在于葡萄球菌中，但其中兩種機械被提議在卵形細菌中發(fā)揮作用，從而加強了不同種類的球菌的形態(tài)發(fā)生的內在差異。

1.3 基于靶向分子學的研究

基于細菌細胞壁可以選擇性透過青霉素的基礎上，青霉素作用機制研究的第三階段，其主要研究結果是闡明了青霉素的作用位點是青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs），研究表明細菌的細胞膜上有特殊的蛋白分子，能與青霉素或頭孢菌素類相結合，稱為“青霉素結合蛋白（PBP）”。1972年，Suginaka[10]等通過放射性同位素標記青霉素的方法檢測到細菌表面的PBP，它具有糖基轉移酶、肽基轉移酶和羧肽酶活性。青霉素的β-內酰胺環(huán)與細菌D-丙氨酰-D-丙氨酸末端具有相似的結構，能與 D-丙氨酰-D-丙氨酸競爭 PBPs的活性位點。并且，相比于 D-丙氨酰-D-丙氨酸，β-內酰胺環(huán)與PBPs的親和性更高。β-內酰胺類抗生素通過β-內酰胺環(huán)中的羧基和細菌相應 PBPs 結合，從而有效控制生物學功能，致使網狀細胞壁無法形成，還可引起細菌形態(tài)改變，導致細菌細胞死亡，以此發(fā)揮殺菌作用（見圖3）[11]。

研究發(fā)現青霉素與不同細菌青霉素結合蛋白結合引起了細菌形態(tài)學改變。一種是與PBP2特異性結合的β-內酰胺類抗生素，能夠使細菌的形態(tài)變成卵形；第二種是與PBP3優(yōu)先結合的β-內酰胺類抗生素，能夠特異性地抑制細菌細胞的分裂；第三種是與PBP1優(yōu)先結合的β-內酰胺類抗生素，抑制細胞的延生并引起細胞的裂解。在沒有PBP1的細菌中，青霉素與PBP2和PBP3結合后，能夠看到細菌細胞會出現“鼓脹”現象。例如：對革蘭陰性的腦膜炎雙球菌，青霉素主要與其膜上PBP1與PBP2結合后，引起細菌形態(tài)的變化，形成絲狀體和球形體，中隔膨脹等，最后導致細菌生長停止，通過細菌直溶酶使細菌溶解死亡。淋病奈瑟菌可用青霉素治療也是同樣的道理。但是青霉素并不是對所有的革蘭陰性菌都有作用，例如一些革蘭陰性桿菌布魯菌屬、假單胞菌屬、大腸埃希菌屬等對其均耐藥，可能由于這些菌缺少PBP[12]。與此同時，發(fā)現革蘭陰性菌的外膜對不易透過青霉素，從而引發(fā)猜想是否與其通透方式或通透性有關。在細菌中，PBPs的數量有很大的不同，而rod型的大腸桿菌有12個，而球菌的數量則更少，通常從4個到7個PBPs。這些數字最初是由在凝膠電泳前用放射性標記的青霉素培養(yǎng)的細胞或膜來確定的。所以說PBPS的不一樣很有可能是最終原因。

2 結語

不過，在經歷了青霉素洗禮、已經奄奄一息的細菌進一步遇到溶菌酶時，居然會發(fā)生意想不到的改變——在溶菌酶的作用下，這些細菌索性脫去了細胞壁，搖身一變，進入了一種叫做“L-form”的形態(tài)。紐卡斯爾大學的這支團隊對L-form形態(tài)的細菌有過報道。此類細菌沒有細胞壁，因此青霉素或溶菌酶等通過破壞細胞壁來殺菌的方法對其不起作用。而有著此類形態(tài)的細菌在人體組織的保護下，還能夠正常生長。研究人員們指出，這也是許多感染復發(fā)的潛在原因之一?；A理論的研究，能推動科學以更快的速度向前發(fā)展，β-內酰胺類抗生素抗菌作用機理的研究，正是在廣泛推行這類抗生素的結構改造迫切需要理論指導的歷史背景下開展起來的，盡管β-內酰胺類抗生素的結構改造已經取得了重要的成就，但這些成就是在驚人龐大的工作規(guī)模下取得的，因為缺少正確的理論指導，在化合物設計中很難避免大量存在的盲目性。所以，當Strominger等在1965年提出β-內酰胺類藥物的作用機制后，不僅很快吸引了更多的人，從各個方面投入這個基礎理論研究，而且使世界β-內酰胺類抗生素的結構改造，出現了逐漸轉向圍繞這個作用機制進行設計研究的趨勢。就本文對一些問題的思考，希望對未來青霉素作用機制的研究提供思路，為開發(fā)更有效的抗菌藥物提供參考。

參考文獻

[1] 李在威，楊頻.青霉素結合蛋白的結構、功能與β-內酰胺抗生素的作用機理研究進展[J].生物化學與生物物理進展，1986（4）：24-29.

[2] Ioerger TR， O'Malley T， Liao R， et al. Identification of new drug targets and resistance mechanisms in Mycobacterium tuberculosis[J].Plos One，2013， 8（9）：75245.

[3] Wright GD. Q&A;： Antibiotic resistance： where does it come from and what can we do about it？[J]. BMC Biol. 2010，8（1）：1-6.

[4] 張韜，倪孟祥，邵雷，等.β-內酰胺抗生素作用機制的研究進展[J].中國抗生素雜志，2015，40（10）：785-790.

[5] Bush K， Pucci MJ. New antimicrobial agents on the horizon[J]. Biochemical Pharmacology， 2011， 82（11）：1528-1539.

[6] Tipper DJ， Strominger JL. Mechanism of action of penicillins： a proposal based on their structural similarity to acyl-D-alanyl-D-alanine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1965， 54（4）：1133-1141.

[7] Jr WE， Park JT. Penicillin： its basic site of action as an inhibitor of a peptide cross-linking reaction in cell wall mucopeptide synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1965，54（1）：75-81.

[8] 周惠殊.β—內酰胺類抗生素的結構改造及構效關系的探討[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，1980（1）：1-22.

[9] Suginaka H， Blumberg PM， Strominger JL. Multiple penicillin-binding components in Bacillus subtilis， Bacillus cereus， Staphylococcus aureus， and Escherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry， 1972， 247（17）：5279.

[10]Guignard B， Entenza JM， Moreillon P. β-lactams against methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. Current Opinion in Pharmacology， 2005，5（5）：479-489.

[11]Spratt BG. Distinct Penicillin Binding Proteins Involved in the Division， Elongation， and Shape of Escherichia coli K12[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1975， 72（8）：2999-3003.