CD163分子對PRRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響

馮麗麗，燕照玲，陳海燕，段俊枝，楊艷艷，孫懷昌

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南 鄭州 450002; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，河南 鄭州 450002； 3.揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種主要以妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)等繁殖障礙和新生仔豬發(fā)生呼吸道疾病為特征的傳染病[1-2]。PRRS最早于1987年在美國被報道，之后迅速蔓延，在世界上大多數(shù)養(yǎng)豬國家都有報道[3-4]。我國于1996年首次從病料中分離到PRRSV，從而證實了PRRS在我國豬群中存在[5]。之后PRRS在我國持續(xù)存在，一直長期流行，對我國生豬養(yǎng)殖業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[6-13]。

PRRSV在豬體內(nèi)具有典型的宿主細(xì)胞親嗜性，主要感染豬肺泡巨噬細(xì)胞[14]。豬肺泡巨噬細(xì)胞是PRRSV主要的天然宿主細(xì)胞，原代分離培養(yǎng)的豬肺泡巨噬細(xì)胞可用于病毒的分離。從豬的子宮內(nèi)可分離到PRRSV，豬的子宮內(nèi)膜細(xì)胞也是PRRSV的天然宿主細(xì)胞[15]。病毒的宿主細(xì)胞親嗜性是由細(xì)胞上的病毒受體決定的，PRRSV感染宿主細(xì)胞的第1步是與細(xì)胞膜上的細(xì)胞受體結(jié)合，從而介導(dǎo)病毒感染細(xì)胞[16]。在PRRSV的天然宿主細(xì)胞豬肺泡巨噬細(xì)胞中，主要有唾液酸黏附素受體(sialoadhesin,Sn)和清道夫受體B(scavenger receptor B,CD163)等，其中CD163分子是PRRSV的主要細(xì)胞受體[17-19]。單獨(dú)轉(zhuǎn)染CD163分子，可將PRRSV非易感細(xì)胞變?yōu)橐赘屑?xì)胞[20]。因此，探索CD163分子在PRRSV感染宿主細(xì)胞過程中的作用，對研究PRRSV的致病機(jī)制具有重要意義。鑒于此，研究了CD163分子對PRRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響，以期為PRRSV致病機(jī)制的研究提供參考，為PRRS的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細(xì)胞及質(zhì)粒

VR2332株P(guān)RRSV、豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞、Marc-145細(xì)胞、包含CD163分子全長的重組質(zhì)粒pVITR-CD163均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實驗室保存。

1.2 主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、RNAiso Plus試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸購自GIBCO公司；用于培養(yǎng) Marc-145 細(xì)胞的改良 DMEM培養(yǎng)基購自北京清大天一科技有限公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Roche公司；Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；抗豬CD163的小鼠免疫血清由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物實驗室制備[21]。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計

參考GenBank中豬CD163分子序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，CD163-F：5′-TGTGAAGTGCTGTCAGTTCT-3′，CD163-R：5′-AAATGTGTCCAGTTCCCTCACT-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段大小為495 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒pVITR-CD163轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞

將含不同質(zhì)量濃度的潮霉素B(50～500 μg/mL)加入培養(yǎng)液中，篩選7～10 d內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的潮霉素B的最小質(zhì)量濃度。若細(xì)胞對潮霉素B敏感性高，在確定的篩選質(zhì)量濃度范圍，再按10 μg/mL的梯度進(jìn)行篩選，最終確定最佳篩選質(zhì)量濃度。用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pVITR-CD163，將提取的無內(nèi)毒素質(zhì)粒按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，以pVITR載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為對照。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中加入確定的潮霉素B篩選質(zhì)量濃度，篩選陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.5 CD163分子的表達(dá)檢測

1.5.1 RT-PCR檢測 在24孔板中培養(yǎng)CD163分子轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到90%時，按RNAiso Plus試劑說明提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用CD163檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5.2 間接免疫熒光試驗 在96孔板中培養(yǎng)CD163分子轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用預(yù)冷的固定液(V丙酮∶V乙醇=3∶2)固定10 min，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，4 ℃過夜，以抗豬CD163的小鼠免疫血清為一抗，以Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗，倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 CD163轉(zhuǎn)基因細(xì)胞感染PRRSV試驗

在24孔板中培養(yǎng)CD163分子轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞(以pVITR載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞為對照)，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，加入0.1 MOI 的VR2332株P(guān)RRSV，37 ℃孵育1 h，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在感染后24、36、48、72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)物。將不同時間點(diǎn)收集的細(xì)胞培養(yǎng)物分別反復(fù)凍融3次，高速離心后收集上清。

在96孔板中培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，將收集的上清10倍倍比稀釋，加入Marc-145細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，37 ℃孵育1 h，用含2% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長情況，直至無細(xì)胞病變孔出現(xiàn)。按Karber法計算TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬CD163分子表達(dá)的檢測

2.1.1 RT-PCR檢測 提取CD163轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用CD163檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞中無擴(kuò)增條帶，CD163轉(zhuǎn)染組在約500 bp處出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。測序結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物為豬CD163編碼序列。

M.DL2000 Marker;1.轉(zhuǎn)染pVITR-CD163質(zhì)粒;2.轉(zhuǎn)染pVITR質(zhì)粒

2.1.2 間接免疫熒光檢測 對CD163轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗，以抗豬CD163的小鼠免疫血清為一抗、Cy3標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行熒光染色。熒光顯微鏡下觀察可見，CD163轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)預(yù)期的熒光，而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞無熒光出現(xiàn)(圖2)。

A.轉(zhuǎn)染pVITR-CD163質(zhì)粒;B.轉(zhuǎn)染pVITR質(zhì)粒

2.2 CD163分子對PRRSV復(fù)制的影響

用PRRSV感染CD163轉(zhuǎn)染的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，在感染后不同時間點(diǎn)收獲PRRSV子代病毒并測定TCID50。結(jié)果顯示，隨感染時間增加，PRRSV子代病毒TCID50均提高；同一時間點(diǎn)CD163轉(zhuǎn)染細(xì)胞組的PRRSV子代病毒滴度均稍高于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，但差異不明顯(圖3)。

圖3 CD163分子轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的PRRSV滴度測定

3 結(jié)論與討論

病毒受體是指能特異性地與病毒結(jié)合、介導(dǎo)病毒侵入細(xì)胞，從而促進(jìn)病毒感染的特殊性細(xì)胞表面位點(diǎn)。病毒受體決定了病毒的宿主范圍及對組織、細(xì)胞的親嗜性[22]。研究表明，CD163是PRRSV感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的重要受體，主要與PRRSV的復(fù)制有關(guān)[20]。Weingartl等[23]構(gòu)建豬肺泡巨噬細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)其對PRRSV不易感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的豬肺泡巨噬細(xì)胞系不表達(dá)巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記CD163分子，將CD163分子轉(zhuǎn)染豬肺泡巨噬細(xì)胞，表達(dá)CD163分子的豬肺泡巨噬細(xì)胞系對PRRSV表現(xiàn)為易感[24]。由此可知，CD163分子在PRRSV的感染過程中扮演著重要角色。PRRSV可以感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，但RT-PCR檢測及間接免疫熒光試驗結(jié)果均表明，豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞表面不表達(dá)CD163分子[25]?？梢姡琍RRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制不同于豬肺泡巨噬細(xì)胞。

Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV在體內(nèi)不感染外周血單核細(xì)胞，但是從血液中新分離的外周血單核細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后部分細(xì)胞對PRRSV易感，并且發(fā)現(xiàn)PRRSV的感染滴度隨著細(xì)胞表達(dá)CD163分子的增多而增高。據(jù)此推測，PRRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞可能隨著CD163的表達(dá)而增強(qiáng)。本研究將CD163分子轉(zhuǎn)染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞，成功構(gòu)建了表達(dá)CD163分子的豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞系。病毒感染試驗結(jié)果表明，PRRSV的感染滴度沒有隨著CD163分子的表達(dá)而增高，轉(zhuǎn)染CD163分子的細(xì)胞組與空載體轉(zhuǎn)染組收獲的子代病毒滴度差異不明顯，這與在外周血單核細(xì)胞上的試驗結(jié)果不一致。本研究結(jié)果提示，PRRSV存在其他決定病毒復(fù)制的受體。

綜上，豬肺泡巨噬細(xì)胞和豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞均為PRRSV的宿主細(xì)胞，豬肺泡巨噬細(xì)胞中重要的病毒受體CD163分子，不僅在豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)，而且在PRRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞的過程中無明顯作用。PRRSV感染豬子宮內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞與豬肺泡巨噬細(xì)胞的機(jī)制不同，需進(jìn)一步探索PRRSV的病毒受體。

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