絞股藍多糖對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響

方磊涵，畢玉霞，王 振，賈悟松

(1.商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘 476100； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095； 3.河南省中獸醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450011)

近年來，隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，飼料中添加了大量的抗生素和化學(xué)合成藥品，造成了藥物在體內(nèi)的殘留及抗藥性，嚴重危害了人體健康，引起了人們的普遍關(guān)注。中草藥具有天然、無公害、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，而且含有多種對機體有益的多糖、蛋白質(zhì)、生物堿、皂苷、微量元素及礦物質(zhì)等成分，具有抑菌殺菌、促進生長、增強機體抵抗力等功效[1-4]。絞股藍作為我國名貴中藥材之首位的“扶正固本”類補益藥物，具有降血糖、降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗氧化及調(diào)節(jié)機體免疫等功效[5]。絞股藍多糖(GPS)是從絞股藍的葉和莖中提取所得的主要活性成分，生物活性非常高，其主要成分是葡萄糖、果糖、半乳糖和低聚糖等[6]。多糖在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用有較多報道，蛋雞飼料中添加黃芪多糖具有改善卵巢功能的作用，可提高蛋雞的產(chǎn)蛋性能[7]；刺五加多糖具有促進仔豬免疫，提高仔豬免疫器官發(fā)育，調(diào)節(jié)仔豬腸道微生態(tài)平衡的作用[8]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在雛雞飼料中添加一定量的絞股藍,可顯著提高雛雞的免疫器官指數(shù)、外周血溶血素含量以及新城疫疫苗免疫后血凝抑制(HI)抗體效價[9]；在豬飼料中添加絞股藍可以促進仔豬生長，降低其發(fā)病率，提高日增質(zhì)量，在降低斷奶仔豬的料肉比、下痢率和死亡率等方面效果也很明顯[10]。但有關(guān)絞股藍多糖對斷奶仔豬影響的研究尚未見報道。為此，以絞股藍為原料提取絞股藍多糖，研究絞股藍多糖對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響，以期為有效利用絞股藍開辟新的途徑，為改善斷奶仔豬腸道pH值、腸道微生物菌群及腸道組織形態(tài)和提高其生產(chǎn)性能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 多糖的制備

1.1.1 GPS的制備 野生絞股藍全草，洗凈，烘干，粉碎后過420 μm篩，分別用適量的95%乙醇和石油醚回流脫脂，除去醇溶性小分子物質(zhì)，濾渣加20倍量的水，80～100 ℃浸提3 h，紗布過濾收集濾液，濾渣再重復(fù)浸提2次，合并濾液，100 ℃水浴濃縮，加入3倍量95%乙醇于4 ℃過夜沉淀。移去部分上清，離心，沉淀用95%乙醇、丙酮各清洗一次，50 ℃干燥5 h，得深棕黑色粉末為GPS，通過 Sephadex-G15 柱層析將粗品純化[11]。每千克烘干絞股藍制取提取物100 g左右，試驗所用劑量以烘干劑量計算。經(jīng)商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院飼料檢測室檢測，絞股藍多糖含量為得到的干粉質(zhì)量。

1.1.2 中藥復(fù)方多糖的制備 中藥復(fù)方多糖是將白術(shù)、茯苓、陳皮、當(dāng)歸、焦三仙、馬齒莧等8種中藥粉碎后，按上述方法提取的多糖。

1.2 試驗動物

試驗于商丘市鳳飛種畜禽有限公司養(yǎng)豬場進行，供試動物為(28±3)日齡平均體質(zhì)量(7.08±0.65)kg的三元雜交(杜×長×大)斷奶仔豬。經(jīng)檢驗，仔豬的初始體質(zhì)量差異不顯著。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設(shè)計 共設(shè)6個處理，每組10個樣本，采用單欄單豬飼養(yǎng)?？瞻讓φ战M飼喂基礎(chǔ)日糧。試驗Ⅰ組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.2%GPS；試驗Ⅱ組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.4%GPS；試驗Ⅲ組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.6%GPS；試驗Ⅳ組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.4%中藥多糖；試驗Ⅴ組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.01%抗生素(含量為15%的金霉素)。試驗所用的GPS、中藥復(fù)方多糖、抗生素分別添加在4%的預(yù)混料中。本試驗預(yù)試期為3 d，正式試驗期為28 d。

1.3.2 試驗日糧 根據(jù)美國NRC豬營養(yǎng)需要量(2001)及該地規(guī)模化養(yǎng)豬生產(chǎn)實際，確定試驗豬的基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分含量配制(表1)，基礎(chǔ)飼糧不添加任何抗生素。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

注：預(yù)混料可為每千克全價料提供維生素A 12 000 IU、維生素D32 500 IU、維生素E 30 IU、維生素K33 mg、維生素B1218 μg、核黃素4 mg、煙酸40 mg、泛酸15 mg、氯化膽堿400 mg、葉酸700 μg、維生素B11.5 mg、維生素B63 mg、生物素100 μg、Zn 80 mg、Mn 20 mg、Fe 83 mg、Cu 25 mg、I 0.48 mg、Se 0.36 mg；*為實測值，**為計算值。

1.3.3 飼養(yǎng)管理 仔豬飼養(yǎng)于排氣通風(fēng)良好、水泥地面的全封閉豬舍，舍溫保持在23～25 ℃，仔豬釆用乳頭式飲水器、可調(diào)式料槽自由飲水和釆食，豬場采用常規(guī)管理進行免疫和驅(qū)蟲。試驗開始后按照分組飼喂不同飼料。各組圈舍條件、管理等均相同。

1.3.4 測定指標(biāo)

1.3.4.1 腸道pH值 試驗結(jié)束時，每組取2頭精神狀態(tài)良好的供試仔豬，頸部放血處死后，迅速剖開腹腔，無菌采集十二指腸、空腸及回腸內(nèi)容物，用PHB-4便攜式精密pH計分別測定其腸道內(nèi)容物pH值。

1.3.4.2 腸道微生物菌群 無菌條件下稱取回腸、盲腸及結(jié)腸各約1.0 g腸道內(nèi)容物，按照岳文斌等[12]的方法進行稀釋、接種、培養(yǎng)及計數(shù)。

1.3.4.3 腸道組織形態(tài) 無菌采集十二指腸、空腸及回腸中部的部位，面積大約為2 cm2，樣品先用生理鹽水洗去內(nèi)容物，然后制成組織切片，在低倍顯微鏡下選擇典型視野，在高倍顯微鏡下觀測視野中完整絨毛，記錄最長絨毛的長度和最深隱窩的深度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

將試驗所得數(shù)據(jù)采用 SPSS軟件進行差異顯著性檢驗，對腸道內(nèi)容物菌數(shù)計算lg值后進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPS對斷奶仔豬腸道pH值的影響

由表2可知，與空白對照組相比，在仔豬飼料中添加不同劑量的GPS，十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物的pH值均有不同程度降低，試驗Ⅱ組效果最佳，其十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物的pH值分別顯著下降5.2%、3.6%和7.9%。

表2 斷奶仔豬飼糧中添加GPS對腸道pH值的影響

注：表中同行數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫字母為差異顯著(P<0.05)，表4同。

2.2 GPS對斷奶仔豬腸道微生物菌群的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗各組回腸、盲腸和結(jié)腸中大腸桿菌數(shù)均有不同程度的降低，試驗 Ⅱ 組回腸、盲腸和結(jié)腸大腸桿菌數(shù)分別顯著降低14.6%、19.9%和12.8%；試驗各組雙岐桿菌數(shù)均提高，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組盲腸中的雙歧桿菌數(shù)分別極顯著提高31.7%、33.8%、33.3%、31.0%；試驗 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組回腸中乳酸桿菌數(shù)分別顯著提高10.8%、13.9%、13.5%、10.5%，盲腸中乳酸桿菌數(shù)分別顯著提高12.8%、15.5%、13.9%、14.2%，結(jié)腸中乳酸桿菌數(shù)分別顯著提高11.0%、13.5%、11.3%、11.0%。以上結(jié)果表明，GPS對斷奶仔豬腸道大腸桿菌有抑制作用，對腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌增殖有促進作用，以在飼料中添加0.4%的GPS效果最好。

表3 斷奶仔豬飼糧中添加GPS對腸道微生物菌群的影響 lgcfu/g

注：同列數(shù)據(jù)標(biāo)不同小寫字母為差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母為差異極顯著(P<0.01)。

2.3 GPS對斷奶仔豬腸道組織形態(tài)的影響

由表4可知，與空白對照組相比，試驗各組十二指腸、空腸、回腸的絨毛長度均增加，試驗 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸絨毛長度分別顯著提高24.8%、25.5%、24.9%；試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組十二指腸、空腸、回腸隱窩深度均顯著降低。

表4 斷奶仔豬飼糧中添加GPS對腸道組織形態(tài)的影響 μm

3 結(jié)論與討論

腸道過高的pH值為大腸桿菌在腸道內(nèi)的繁殖創(chuàng)造了有利條件。周韶等[13]研究表明，飼喂pH值為5.8～6.5的飼料時，可使仔豬胃腸道內(nèi)容物pH值升高，導(dǎo)致病原微生物大量繁殖，仔豬出現(xiàn)消化不良、腹瀉及生長緩慢等癥狀，添加低聚木糖后，仔豬胃腸內(nèi)容物的pH值明顯降低，消化酶的活性和乳酸桿菌含量提高，病原微生物生長繁殖受到抑制。本研究結(jié)果表明，在仔豬日糧中添加GPS，可有效降低小腸各段的pH值。這與王留等[14]報道的保育豬小腸有大量微生物，添加多糖可促進細菌發(fā)酵產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸和乳酸、降低食糜 pH值一致。

本試驗結(jié)果表明，在日糧中添加不同水平的GPS，仔豬腸道乳酸桿菌數(shù)和雙歧桿菌數(shù)均明顯提高，大腸桿菌數(shù)量明顯降低。乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌是動物腸道內(nèi)的主要菌群，曹國文等[15]通過提高動物腸道中有益菌的數(shù)量，降低有害菌的數(shù)量，從而改善動物腸道微生物菌群，以提高動物的生長性能和抗病力。中草藥與乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌具有協(xié)同作用[16-19]。張宏福等[20]研究結(jié)果表明，飼料中添加異麥芽低聚糖不但可有效抑制大腸桿菌的生長，而且可提高仔豬腸道中有益菌(乳酸桿菌和雙歧桿菌等)的數(shù)量。許梓榮等[21]研究發(fā)現(xiàn)，外源性多糖、有機酸等營養(yǎng)物質(zhì)可對動物腸道正常微生物菌群的增殖起到促進作用。本試驗結(jié)果表明，添加GPS能促進斷奶仔豬腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌的增殖，抑制大腸桿菌的增殖。

王芳芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，絨毛長度和隱窩深度反映小腸的功能狀態(tài)，絨毛變長，營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力提高；隱窩深度反映小腸上皮細胞成熟上升，分泌功能增強。本研究在斷奶仔豬日糧中添加GPS發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，試驗各組十二指腸、空腸、回腸的絨毛長度均增加，十二指腸、空腸、回腸隱窩深度均降低。仔豬小腸絨毛長度增加，隱窩深度變淺，有利于提高斷奶仔豬對養(yǎng)分的消化利用率，這與蘇家宜等[23]、張文飛等[24]報道相一致。

斷奶仔豬日糧中添加GPS能夠降低仔豬腸道內(nèi)容物pH值，促進乳酸桿菌和雙歧桿菌的增殖，抑制大腸桿菌的增殖；促進腸絨毛的生長發(fā)育，降低隱窩深度，提高消化吸收能力，從而促進營養(yǎng)物質(zhì)的利用。在降低仔豬腸道食糜的酸度及對斷奶仔豬腸道微生物菌群的調(diào)節(jié)方面，以在飼料中添加0.4%的GPS效果最好。

[1] 胡廣英,王紅妍,車向榮,等.中藥添加劑對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(3):263-266.

[2] 曹日亮,車向榮,王紅妍,等.中藥添加劑對斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)和養(yǎng)分消化率的影響[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):183-187.

[3] 郭巧萍.抗生素替代物對畜禽生產(chǎn)的影響研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(5):553-554,558.

[4] 李瑞珍,高沂,宋獻藝,等.后抗生素時代生物飼料添加劑研發(fā)狀況與對策[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(2):170-173.

[5] 畢玉霞,王紅軍.絞股藍的藥理作用及優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培技術(shù)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,33(3):447,476.

[6] 馬麗萍,趙培榮,張惠芳,等.絞股藍不同部位多糖含量的測定[J].河南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2000,35(5):445-446.

[7] 高楊,王洪芳,陳輝,等.飼糧添加黃芪多糖對蛋雞免疫功能及腸道菌群的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2011,23(3):447-451.

[8] 韓杰,邊連全,劉顯軍,等.刺五加多糖對斷奶仔豬生長性能和免疫指標(biāo)的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2012,24(11):2203-2209.

[9] 戈勝,姜曉文,王志新,等.絞股藍對雛雞免疫功能的影響[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2010,29(3):32-34.

[10] 申紅春.絞股藍對斷奶仔豬抗氧化能力及免疫功能的影響[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2012,30(1):64-66,81.

[11] 尚曉婭,飲傳光,曹剛,等.絞股藍多糖提取分離、化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(3):514-518,540.

[12] 岳文斌,車向榮,臧建軍,等.甘露寡糖對斷奶仔豬腸道主要菌群和免疫機能的影響[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2002,22(2):97-101.

[13] 周韶,黃華山,楊在賓,等.低聚木糖對仔豬生產(chǎn)性能和腸道微生物影響的研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,42(1):84-88.

[14] 王留,王向國.大棗多糖對保育豬腸道微生物菌群及腸道組織形態(tài)的影響[J].養(yǎng)豬,2014(4):7-8.

[15] 曹國文,曾代勤,戴榮國,等.中草藥添加劑對斷奶豬腸道菌群與生產(chǎn)性能的影響[J].中國獸醫(yī)科技，2003,33(11):54-58.

[16] 王國強，王秋文，樊春光，等.復(fù)合益生菌發(fā)酵豆粕的技術(shù)參數(shù)優(yōu)化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016,45(8):140-143.

[17] 韓慶功，宋云義，崔艷紅，等.牛至油對仔豬生產(chǎn)性能、抗體水平及糞便微生物的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016，45(7):113-117.

[18] 李連缺，孟志敏，米同國，等.復(fù)合酸對老齡蛋雞日糧pH值和消化道內(nèi)環(huán)境的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，44(8)：128-132.

[19] 陳樹河，陳秋，常云勝，等.復(fù)合益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用機制研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，45(4):12-18.

[20] 張宏福,徐秀容,盧慶萍,等.異麥芽低聚糖對早期斷奶仔豬腸道主要菌群的影響[J]．動物營養(yǎng)學(xué)報,2001,13(7):47-51.

[21] 許梓榮,胡彩虹.寡果糖對肥育豬生長性能、腸道菌群和免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2003,23(1):69-71.

[22] 王芳芳,刁華杰,王志龍,等.中草藥添加劑對斷奶仔豬腸道菌群與生長性能的影響[J].中國畜牧雜志,2017,53(3):121-127.

[23] 蘇家宜,李華偉,黎智華,等.發(fā)酵中藥渣對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2016,28(9):1454-1459.

[24] 張文飛,劉蘋蘋,管武太,等.飼料中添加卵黃抗體對斷奶仔豬生長性能、血清生化指標(biāo)、腸道形態(tài)及腸道微生物菌群的影響[J].動物營養(yǎng)學(xué)報,2017,29(1):271-279.