遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因的檢測與分析

趙鳳菊，關(guān) 淼，李清竹，顧貴波

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164)

抗生素耐藥性是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-3]。喹諾酮類藥物特別是新型喹諾酮類藥物是人工合成的廣譜抗菌劑，在一些國家被廣泛應(yīng)用于家畜和寵物的臨床治療[4-5]。目前，喹諾酮類主要有3種耐藥機(jī)制：藥物靶位改變(質(zhì)粒介導(dǎo)機(jī)制)、外膜通透性減低(被膜機(jī)制)和外排溢出泵(外排泵機(jī)制)[6]。其中，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥機(jī)制有3種：第1種是質(zhì)粒介導(dǎo)的qnr機(jī)制，qnr基因在多種腸道細(xì)菌中存在，其編碼的蛋白質(zhì)屬于五肽重復(fù)家族的重要成員之一，可以保護(hù)DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，抑制喹諾酮類藥物[7-8]；第2種機(jī)制與aac(6′)-Ib-cr基因相關(guān)，aac(6′)-Ib-cr是aac(6′)-Ib的變異體，其編碼的蛋白質(zhì)能夠使哌嗪基乙?；?從而降低細(xì)菌環(huán)丙沙星或諾氟沙星的敏感性[9]；第3種機(jī)制是基于喹諾酮類外排泵蛋白的qepA基因，其編碼的蛋白質(zhì)可以耐萘啶酸和諾氟沙星[5]。DNA解旋酶由gyrA和gyrB基因編碼，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ由parC和parE基因編碼，gyrA和parC之間、gyrB和parE之間的序列具有很高的同源性[10]。DNA解旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ蛋白的氨基酸突變是喹諾酮類藥物的主要耐藥機(jī)制之一[11]。大腸埃希菌是引起人和動物感染的主要微生物之一[12]，在大腸埃希菌中g(shù)yr基因和par基因的耐藥突變率很高，大多數(shù)喹諾酮耐藥決定區(qū)位于gyrA67～106位、parC56～108位[10]。

為了解遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中喹諾酮類耐藥基因(PMQR)的分布特點(diǎn)及gyr基因和par基因編碼的喹諾酮耐藥決定區(qū)突變特征，對23株喹諾酮類抗生素耐藥大腸埃希菌11個PMQR基因進(jìn)行PCR檢測及序列分析，為進(jìn)一步研究喹諾酮類抗生素耐藥機(jī)制提供理論依據(jù)，并為獸醫(yī)臨床喹諾酮類抗生素的合理使用、新型藥物的研發(fā)以及豬大腸埃希菌病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 23株對喹諾酮類抗生素耐藥大腸埃希菌從遼寧不同地區(qū)病死豬或患病豬的組織臟器、活豬糞便中分離得到，由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基(生產(chǎn)批號分別為20130608、20130708)購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(MH)、藥敏紙片(生產(chǎn)批號分別為140506、140506)均購自杭州市天和微生物試劑有限公司，DNAzol提取試劑購自Invitrogen公司，PrimeSTAR? HS DNA Polymerase with GD Buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×ExTaqBuffer、2.5 mmol/L dNTPs、DNA Marker、溴化乙錠均購自大連寶生物科技有限公司。

1.1.3 PCR擴(kuò)增引物 根據(jù)GenBank上登錄的gyrA、gyrB、parC、parE、aac(6′)-Ib-cr、qepA、qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了11對特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA模板的制備 挑取培養(yǎng)18～24 h的培養(yǎng)物，用1 mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4 ℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一個1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4 ℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，用無菌水配制的75%乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐藥基因及耐藥譜檢測 采用25 μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，滅菌水16.375 μL，模板 2 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，退火溫度(根據(jù)引物選擇合適退火溫度，表1) 45 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

采用藥敏紙片法測定耐藥譜。

1.2.3 序列測定 將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，進(jìn)行g(shù)yr和par基因突變分析。并將基因序列推導(dǎo)為氨基酸序列，分析突變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMQR基因檢測結(jié)果及菌株耐藥譜分析

利用PCR檢測方法，對23株喹諾酮類耐藥菌株進(jìn)行耐藥基因檢測(表2)。結(jié)果表明，20株供試菌為PMQR基因陽性，陽性率為86.96%(20/23)，21.74%(5/23)的菌株攜帶3種PMQR基因，39.13%(9/23)的菌株攜帶2種PMQR基因，26.09%(6/23)的菌株攜帶1種PMQR基因，13.04%(3/23)的菌株未檢測到PMQR基因。其中,主要PMQR基因是aac(6′)-Ib-cr基因，陽性率為73.91%(17/23)；其次為qepA、qnr基因(qnrB、qnrC、qnrS基因)，陽性率分別為52.17%(12/23)、39.13%(9/23)；qnrA、qnrD基因未被檢測到。

23株喹諾酮類耐藥菌株耐藥譜廣，均對萘啶酸耐藥。

2.2 gyr和par基因突變檢測結(jié)果

23株喹諾酮類耐藥菌株均對萘啶酸耐藥，選取15株耐藥菌株進(jìn)行g(shù)yrA、gyrB、parC和parE基因的序列測定分析，將基因序列推導(dǎo)為氨基酸序列，分析突變情況(表3)。從表3可以看出，gyrA在第87位氨基酸的突變率為80%(12/15)，其中1株該位點(diǎn)的天冬氨酸被谷氨酸所替代，11株該位點(diǎn)的天冬氨酸被天冬酰胺所替代；gyrB基因在第426位、447位氨基酸的突變率分別為80%(12/15)、100%(15/15)，12株第426位的天冬氨酸被天冬酰胺所替代，15株第447位的賴氨酸被谷氨酸所替代；parC基因在第56位、80位氨基酸的突變率分別為20%(3/15)、73.33%(11/15)，3株第56位的丙氨酸被蘇氨酸所替代，11株第80位的絲氨酸被異亮氨酸所替代；parE基因未檢出突變。在15株突變株中，K447E的突變率最高，其次為D87N、D426N、S80I和A56T。

表2 大腸埃希菌中喹諾酮類耐藥基因的檢測結(jié)果及耐藥譜

表3 喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析

注：A.丙氨酸；D.天冬氨酸；E.谷氨酸；K.賴氨酸；I.異亮氨酸；N.天冬酰胺；S.絲氨酸；T.蘇氨酸；WT.野生型。

3 結(jié)論與討論

喹諾酮類抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性越來越嚴(yán)重，質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮抗性基因易在不同菌屬之間傳播，導(dǎo)致常見傳染病的治療非常困難[13]。在世界各地，qnr、aac(6′)-Ib-cr、qep和oqx質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因在人和供食品生產(chǎn)動物的細(xì)菌分離株中已有報道[14]。目前，已在大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)aac(6′)-Ib-cr基因，在大腸埃希菌中最常見[15]。qnr基因在多個國家的多種腸桿菌科細(xì)菌中均有檢出，分布較為廣泛，其中qnrA基因于1998年肺炎克雷伯菌的臨床分離株中被確定，隨后qnrB基因和qnrS基因在大腸埃希菌、沙門氏菌、肺炎克雷伯菌中被發(fā)現(xiàn)[16]。攜帶qepA基因和oqxAB基因的大腸埃希菌臨床分離株分別在2002年和2008年被發(fā)現(xiàn)[14]。本研究中，PMQR基因的陽性率高達(dá)86.96%，其中aac-(6′)-Ib-cr基因的檢出率最高，占檢測菌株的73.91%，其次為qepA、qnr基因。

人們首先在金黃色葡萄球菌和假單胞菌中發(fā)現(xiàn)由于突變的原因產(chǎn)生喹諾酮類抗藥性現(xiàn)象[10]。對喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制涉及gyrA基因和parC基因的喹諾酮耐藥決定區(qū)的突變，最常見的突變是gyrAS83位、D87位，parCG78、S80、E84位[17]。此外，能導(dǎo)致大腸埃希菌對喹諾酮類藥物耐藥的突變是gyrBD426、K447位，parEL445位[18]。gyrA第83位氨基酸突變可能是大腸埃希菌對喹諾酮類耐藥的首要條件，而gyrA第87位和parC第80位氨基酸突變是導(dǎo)致高水平耐藥的必要條件[15]。gyrB上D426N的突變可使菌株對所有的喹諾酮類藥物耐藥，而K447E的突變則能增強(qiáng)菌株對萘啶酸的耐藥性[19]。本研究中，15株耐藥菌株中有12株的gyrA亞基出現(xiàn)氨基酸突變，15株的gyrB亞基均發(fā)生突變，11株的parC亞基發(fā)生突變，而parE亞基中未檢出突變，并且突變類型與報道的一致[15,17-18]。

綜上，在遼寧地區(qū)PMQR耐藥基因及靶位突變成為豬源大腸埃希菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因。因此，有必要加強(qiáng)該地區(qū)耐藥基因及耐藥基因突變的監(jiān)控，指導(dǎo)臨床合理用藥，降低因喹諾酮類耐藥造成的經(jīng)濟(jì)損失。

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