馬鈴薯黑脛病抗性品種的篩選與評價

宋 揚，郝建軍，王樹桐，胡同樂，王亞南，王曉燕，曹克強*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，河北 保定 071001； 2.緬因大學 食品與農(nóng)業(yè)學院，緬因州 奧羅諾 04473；3.河北農(nóng)業(yè)大學 生命學院，河北 保定 071001)

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，目前世界馬鈴薯年平均種植面積高達1 920萬hm2，鮮薯的年總產(chǎn)量達3.9億t。而中國馬鈴薯種植面積為557.3萬hm2，占世界總種植面積的1/4。繼2015年我國提出了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略以來，馬鈴薯的生產(chǎn)越來越受到民眾和外界的關注，未來將成為我國主要糧食作物之一[1]。馬鈴薯黑脛病是世界馬鈴薯種植中的重要病害[2]，近些年在我國發(fā)生越來越嚴重[3]，威脅著馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

馬鈴薯黑脛病是由果膠桿菌(Pectobacteriumspp.)和Dickeyaspp.引起的發(fā)生在馬鈴薯植株莖基部及塊莖上的嚴重病害，該病害主要侵染維管束組織，從種薯發(fā)芽到生長后期均可發(fā)病，以苗期最盛[4]。病害主要通過帶病種薯和土壤進行傳播擴散，病原菌因隱藏在植物的皮孔及木栓化組織中，很難被殺死，且繁殖傳播速度快。目前，生產(chǎn)上對該病害的防治以預防為主[5]，選育和種植馬鈴薯抗性品種是有效防治方法之一。雖然我國目前種植的馬鈴薯品種繁多，但抗馬鈴薯黑脛病的品種匱乏，抗性品種多來自于國外引種[6]。為了實現(xiàn)馬鈴薯的安全生產(chǎn)，河北農(nóng)業(yè)大學與美國緬因大學開展了合作研究，通過對來自美國的24個馬鈴薯種質材料進行人工接種病原菌，在室內離體與溫室盆栽條件下分別測定不同馬鈴薯品種的抗病等級，對其進行抗黑脛病評價，旨在篩選出具有良好抗性的材料，為更好地防控黑脛病奠定基礎，也為我國馬鈴薯的抗性引種和育種提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試病原菌

馬鈴薯黑脛病病原菌DickeyadianthicolaME30、PectobacteriumwasabiaeWPP163由美國緬因大學Hao’s Lab 提供。

1.2 供試馬鈴薯品種

包括Rideau、Nordak、Pioneer、Norland、Stately、Norcheif、Rosegold、Norvalley、Super Red Norland、Warba、Nordonna、Atlantic、Sebago、Rural New Yorker、Red Warba、White Cloud、Reba、Satapa、Wasca、Pantonac、Red Burt、Ranger Russet、Norglean和Sangre。24個馬鈴薯品種均由美國緬因大學提供，保存于緬因大學冷藏室中備用。

1.3 供試試劑

TSA(tryptic soy agar)培養(yǎng)基、TSB(tryptic soy broth)培養(yǎng)基、0.6%的次氯酸鈉等所有試劑均購自美國SIGMA-ALORICH公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液的制備 將由-80 ℃超低溫冰箱中取出的ME30、WPP163，于28 ℃條件下在TSA培養(yǎng)基上復壯48 h。挑取菌株單菌落于100 mL 高溫滅菌過的TSB培養(yǎng)基中，搖培24 h，設置搖培條件：180 r/min、28 ℃。用平板計數(shù)法調節(jié)菌懸液濃度至108cfu/mL。

1.4.2 離體條件下馬鈴薯品種的抗性測定

1.4.2.1 馬鈴薯整薯的接種 挑取無病馬鈴薯，經(jīng)0.6%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，用清水沖洗后備用。在馬鈴薯兩端選取適當位置(兩位置之間間隔大于3 cm)，用滅菌的1 mL槍頭在馬鈴薯上造成1.5 cm深的傷口，接入50 μL的菌懸液，貼上標簽紙。試驗設置2種病原菌，24個馬鈴薯品種，每個處理設置3次重復，以無菌水為對照。將浸水的濕紙巾鋪于已滅菌的容器底部，放置帶孔隔板，將馬鈴薯置于隔板之上，蓋上容器的蓋子以維持濕度。于28 ℃黑暗環(huán)境下培養(yǎng)5 d后檢查發(fā)病情況[7]。

1.4.2.2 離體條件下馬鈴薯發(fā)病情況的調查 沿接種的孔隙縱向切開，在縱切面上測量接種點以下腐爛區(qū)域的深度及寬度，以深度與寬度的乘積模擬腐爛區(qū)域縱切面面積，表示腐爛程度。參照Lapwood等[7]的方法并做改進，對不同品種進行抗性分級，分級標準如下：腐爛程度(深度×寬度)數(shù)值為0～1的馬鈴薯品種的抗病類型為高抗(HR)；1～2的品種為抗(R)；2～3的品種為中抗(MR)；3～4的品種為中感(MS)；≥4的品種為感病(S)。

1.4.3 溫室條件下馬鈴薯品種的抗性測定

1.4.3.1 試驗溫室條件概況 試驗在美國緬因大學植病流行與綜合防治試驗溫室中進行，常年濕度在70%左右，溫度控制在20 ℃左右。馬鈴薯實施盆栽，種植在容積4 L的盆中，光照條件為16 h光照、8 h黑暗，所使用土壤(Kids b kids)購自美國沃爾瑪超市。

1.4.3.2 病原菌的接種 將帶芽的無病馬鈴薯切成兩半，傷口在超凈臺中愈合48 h后種植于無菌培養(yǎng)土中。種植1周后開始灌溉，采用噴灌，每3 d一次。種植25～30 d時，于馬鈴薯植株莖基部15～20 cm處接種10 μL 106cfu/mL的菌懸液[8]。試驗設置2種病原菌，24個馬鈴薯品種，每個處理設置4個重復，以注射無菌水作為對照，采用隨機區(qū)組排列盆栽。

1.4.3.3 病害的調查 接種病原菌16 d后進行病害調查。以接種點為中心，調查上下各5 cm范圍內發(fā)病面積。按照以下評級方法對馬鈴薯的抗性進行評價：調查范圍內無病害發(fā)生，抗病等級為0；發(fā)病面積占調查面積25%以下，抗病等級為1；發(fā)病面積占調查面積25%～50%，抗病等級為2；發(fā)病面積占調查面積50%～75%，抗病等級為3；發(fā)病面積占調查面積75%～100%，抗病等級為4。當0≤抗病等級平均值<1時，抗病類型為高抗(HR)；當1≤抗病等級平均值<2時，抗病類型為抗(R)；當2≤抗病等級平均值<3時，抗病類型為中抗(MR)；當3≤抗病等級平均值<4時，抗病類型為中感(MS)；當抗病等級平均值=4時，抗病類型為感(S)。

2 結果與分析

2.1 離體條件下馬鈴薯品種對P.wasabiae WPP163的抗性評價

對人為制造傷口、接種病原菌WPP163后的馬鈴薯進行發(fā)病情況調查，結果見表1。表現(xiàn)抗性(R)的品種有Sangre、Norglean、Ranger Russet、Red Burt 4份，腐爛程度分別為1.11、1.30、1.36、1.59，占所測試馬鈴薯品種的16.67%；表現(xiàn)為中抗(MR)的馬鈴薯品種有Pantonac、Wasca、Satapa、Reba、White Cloud、Red Warba、Rural New Yorker、Sebago、Atlantic 9份，占測試總品種數(shù)的37.5%；表現(xiàn)為中感(MS)的馬鈴薯品種有Nordonna、Warba、Super Red Norland、Norvalley、Rosegold、Norcheif 6份，占到了供試材料的25%；而感病(S)的品種為Stately、Norland、Pioneer、Nordak、Rideau 5份，占供試馬鈴薯品種的20.83%。

表1 室內離體條件下不同馬鈴薯品種對P.wasabiae WPP163的抗性評價

注：數(shù)據(jù)后不同小寫英文字母表示在0.05水平上差異顯著(Duncan氏新復極差法)，下同。

2.2 離體條件下馬鈴薯品種對D.dianthicola ME30的抗性評價

從表2可以看出，對病原菌ME30表現(xiàn)高抗(HR)的品種有1份，為Ranger Russet，腐爛程度為0.81，占供試馬鈴薯材料的4.17%；表現(xiàn)為抗性(R)的品種有Wasca、Satapa、Pantonac、Sangre 4份，腐爛程度分別為1.16、1.59、1.81、1.96，占測試馬鈴薯品種總數(shù)的16.67%；表現(xiàn)為中抗(MR)的品種有Red Warba、Sebago、Norcheif、Super Red Norland、Stately、Rural New Yorker 6份，所占比例為25%；而表現(xiàn)為中感(MS)的馬鈴薯品種有Norvalley、Norglean、Norland、Warba、White Cloud、Red Burt、Nordak、Rosegold 8份，占總數(shù)的33.33%；表現(xiàn)為感病(S)的品種有Rideau、Atlantic、Nordonna、Pioneer、Reba 5份，占總數(shù)的20.83%。

表2 室內離體條件下不同馬鈴薯品種對D.dianthicola ME30的抗性評價

2.3 溫室盆栽條件下馬鈴薯品種對P.wasabiae WPP163的抗性評價

溫室活體條件下，利用注射法接種病原菌WPP163，待馬鈴薯發(fā)病后調查病害的嚴重程度，結果如表3所示。24個測試品種中，Ranger Russet、Sangre、Norglean較抗病，平均抗病等級分別為1.0、1.3、1.3；Wasca、Pantonac、Red Burt、Satapa、Reba、White Cloud、Red Warba具有一定的抗病性，平均抗病等級分別為2.0、2.0、2.3、2.3、2.3、2.7、2.7。供試的馬鈴薯品種中，具抗性的品種占41.67%，其余為中感與感病品種。接種馬鈴薯黑脛病菌WPP163后，品種Sangre、Norglean、Ranger Russet無論在離體或溫室活體條件下都表現(xiàn)出良好抗性。

表3 溫室活體條件下不同馬鈴薯品種對P.wasabiae WPP163的抗性評價

2.4 溫室盆栽條件下馬鈴薯品種對D.dianthicola ME30的抗性評價

從表4可以看出，對病原菌ME30表現(xiàn)為高抗的馬鈴薯品種有1份，為Ranger Russet，平均抗病等級為0.7；Wasca、Satapa、Sangre表現(xiàn)為抗病，平均抗病等級分別為1.0、1.7、1.7；具有中度抗性的馬鈴薯品種為Pantonac、Red Warba、Sebago、Norcheif、Rural New Yorker，平均抗病等級分別為2.0、2.3、2.3、2.7、2.7。具抗性的馬鈴薯品種共有9份，占供試品種的37.5%，中感與感病品種共占到供試品種的62.5%。24個品種中，Sangre、Satapa、Wasca、Ranger Russet在活體與離體條件下對病原菌ME30都表現(xiàn)出良好抗性。

表4 溫室活體條件下不同馬鈴薯品種對D.dianthicola ME30的抗性評價

續(xù)表4 溫室活體條件下不同馬鈴薯品種對D.dianthicola ME30的抗性評價

3 結論與討論

采用人工接種的方法，可在室內創(chuàng)造病害發(fā)生發(fā)展的條件，完成對抗馬鈴薯黑脛病品種的篩選與科學評價，快速高效，有助于為馬鈴薯的抗病育種提供親本材料。本試驗中所用的改進自Lapwood等[7]的新抗性評價方法，同時測量了腐爛區(qū)域的寬度與深度，因腐爛區(qū)域是一個立體圖形，所以這種評價方式比僅測量寬度的方法更客觀。以深度與寬度的乘積表示腐爛程度，省去了原方法中稱量馬鈴薯質量的步驟，更加省時高效。利用改進后的方法對24份品種進行篩選，獲得了在室內離體條件下對DickeyadianthicolaME30、PectobacteriumwasabiaeWPP163 2種病原菌均有良好抗性的馬鈴薯品種Ranger Russet和Sangre，為后期抗性品種的田間評價提供了理論依據(jù)[9]。

歐美國家在馬鈴薯黑脛病方面的研究開展較早，且特別重視對于抗病品種的鑒定與搜集，因此，由國外引進的馬鈴薯品種其抗性往往高于目前國內所種植的品種[10]。本試驗通過對24份由美國緬因大學提供的馬鈴薯品種進行抗性評價，篩選出了在室內離體條件與溫室活體條件下，對病原菌P.wasabiaeWPP163具有良好抗性的馬鈴薯品種Sangre、Norglean、Ranger Russet，對病原菌D.dianthicolaME30具有良好抗性的馬鈴薯品種Ranger Russet、Wasca、Satapa、Sangre，其中Ranger Russet和Sangre對2種病原菌均有良好抗性，這不僅對馬鈴薯的安全生產(chǎn)具有指導意義，而且也為我國馬鈴薯抗性材料的引種和抗性育種提供了可靠材料和理論依據(jù)。

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